布比卡因增强小鼠成肌细胞溶酶体的活性

熊静薇 毛雨 李荣荣 丁正年

布比卡因是临床上常用的局部麻醉药(local anesthetics，LA)，其镇痛效果显著且持续时间长，因而广泛应用于手术中区域麻醉和手术后疼痛管理。研究证实，临床上使用的局部麻醉药均存在骨骼肌毒性，过量使用会引起注射部位的肌肉组织缺血坏死，肌纤维断裂。其中，布比卡因的肌毒性最大［1］。

溶酶体是一组含有多种水解酶，并起消化作用的细胞器，专司降解各种外源性和内源性的大分子物质。在外伤、炎症、缺血等病理状态下，细胞异噬和自噬活动增强，溶酶体数目增加，以适应细胞的吞噬功能，如中性粒细胞和巨噬细胞［2］。但是溶酶体是否参与布比卡因所致的肌肉损伤，目前尚不清楚。为探讨该问题，我们采用小鼠成肌细胞C2C12体外培养模型，分析布比卡因对C2C12细胞溶酶体数量与活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料小鼠成肌细胞C2C12来自美国模式菌种收集中心(ATCC)。布比卡因、氯喹和α-Tubulin抗体购自美国SigmaAldrich公司。DMEM细胞培养基，胎牛血清(FCS)，LysoSensor Yellow/Blue DND-160和LysoTracker Red DND-99均购自美国Invitrogen Life技术公司。胰蛋白酶250为北京经科试剂公司产品。MagicRed Cathepsin assay kit试剂盒购自美国Immuno-Chemistry公司。溶酶体相关膜蛋-1(LAMP-1)抗体购自美国Cell Signaling技术公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与实验分组:用含10%FCS的DMEM培养基培养C2C12细胞，达到80%单层融合时传代并分为2组。对照组:细胞培养液中不加任何药物;布比卡因组:细胞培养液中加入600 μmol/L布比卡因刺激细胞6 h。

1.2.2 溶酶体腔pH评价:LysoSensor Yellow/Blue DND-160在酸性环境中表现出pH依赖的荧光强度增加［3-4］。用24孔板培养C2C12细胞，布比卡因(600 μmol/L)或者氯喹(10 μmol/L)刺激细胞6 h后，加入LysoSensor试剂(5 μmol/L)孵育1 h。于激光共聚焦显微镜下检测荧光强度，激发/发射波长为329/440～450 nm，并拍摄图片。

1.2.3 示踪溶酶体:布比卡因刺激C2C12细胞6 h后，加入LysoTracker Red DND-99试剂(75 nmol/L)孵育30 min［5-8］。于激光共聚焦显微镜下检测激光强度，激发/发射波长为577/590 nm，并拍摄图片。

1.2.4 蛋白质免疫印迹法检测LAMP-1和Cathepsin B水平:布比卡因刺激C2C12细胞6 h后收集细胞，提取胞浆蛋白，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转膜，牛奶封闭，一抗4℃过夜。彻底洗涤后，加入HRP标记的二抗4℃孵育2 h。显影剂显色后，暗室曝光在X光胶片上。LAMP-1和Cathepsin B表达量以LAMP-1和Cathepsin B与α-Tubulin比值表示。每组实验重复3次。

1.2.5 Cathepsin B活性分析:布比卡因刺激C2C12细胞6 h后，加入MagicRed染料避光孵育45 min。用荧光计测量荧光强度，激发/发射波长为590/645 nm。于荧光显微镜下拍摄图片。

1.3 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据均用均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 布比卡因不影响C2C12细胞溶酶体腔pHLysoSensor Yellow/Blue DND-160是一种有荧光标记的向酸性染料，由于质子化作用聚集于酸性细胞器，其荧光强度随溶酶体腔pH的变化而改变。溶酶体腔正常呈酸性(pH为3.5～5.5)。氯喹具有碱化溶酶体的作用，因此常被用作溶酶体碱化的工具药物。本实验中，氯喹处理的细胞作为溶酶体碱化阳性对照。如图1所示，与对照组相比，布比卡因组溶酶体荧光强度无变化，氯喹组荧光几乎猝灭。本结果提示布比卡因不影响C2C12细胞的溶酶体腔pH。

图1 布比卡因对溶酶体pH的影响(n=3)

2.2 布比卡因增加C2C12细胞溶酶体含量Lyso-Tracker Red DND-99是一种荧光标记的亲脂性染料，具有高度选择性，能够透过细胞膜而积聚于活细胞溶酶体。用LysoTracker标示溶酶体，检测溶酶体含量，以平均荧光强度为单位，布比卡因组为44092±750.88，对照组为38289.75±585.01，布比卡因组的荧光单位增加15.15%(P＜0.01)，见图2。本结果提示布比卡因增加C2C12细胞溶酶体含量。

图2 布比卡因溶酶体含量的影响(n=4)

2.3 布比卡因增加C2C12细胞LAMP-1表达LAMP-1特异性的表达于溶酶体膜上，是溶酶体再生过程中必不可少的组成部分。以相对灰度为单位，布比卡因组蛋白表达量为1.36±0.02，对照组为1.0±0.07，布比卡因组LAMP-1蛋白表达量增加36.41%(P＜0.01)，见图3。本结果提示布比卡因增加C2C12细胞LAMP-1表达量。

图3 布比卡因对LAMP-1蛋白表达量的影响

2.4 布比卡因增强C2C12细胞溶酶体活性溶酶体活性与溶酶体蛋白水解酶Cathepsin B活性成正相关。以相对灰度为单位，布比卡因组Cathepsin B蛋白表达量为1.35±0.21，对照组为1.0±0.15，布比卡因组Cathepsin B蛋白表达量增加35.29%(P＜0.01)，见图4。用MagicRed染色检测Cathepsin B活性，如图5所示，与对照组相比，布比卡因组荧光强度增加23.74%(P＜0.01)。本结果提示布比卡因增强C2C12细胞的溶酶体活性。

图4 布比卡因对Cathepsin B蛋白表达量的影响

3 讨论

局部麻醉药是临床实施局部麻醉和镇痛所必需的药物。静脉泵镇痛，硬膜外置管镇痛及周围神经阻滞都需要局部麻醉药参与［9-10］。关于局部麻药所致肌毒性的分子机制的讨论有很多。其中，局部麻药引起的细胞内钙离子浓度增加被认为是引起急性细胞毒性的主要因素。局部麻药诱导钙离子从肌浆网释放，同时抑制肌浆网对钙的重吸收，破坏细胞内钙离子的稳态［11］。抑制线粒体功能会加重局麻药肌毒性［12-13］，诱导凋亡也与局部麻药肌毒性有关［14］。

溶酶体是一组含有多种水解酶，并起消化作用的细胞器，在蛋白质降解中具有重要的作用。病理条件下，严重的细胞损伤会破坏溶酶体膜的渗透性，引起溶酶体酶释放，细胞水解，最终导致细胞死亡。在布比卡因介导的肌毒性中，溶酶体是否被激活是本研究关注的重点。

图5 布比卡因对Cathepsin B活性的影响(×400，n=3)

溶酶体pH与细胞的消化降解能力密切相关。溶酶体腔正常pH为3.5～5.5，这种酸性环境被认为最有利于水解酶发挥作用。LAMP-1是位于溶酶体膜上的一类特异的蛋白质。溶酶体水解酶是溶酶体蛋白降解系统中一组参与细胞代谢、肽链合成及蛋白降解的蛋白水解酶［15］。溶酶体水解酶分为2大类，前者包括半胱氨酸蛋白酶类如Cathepsin B、L、S，后者包括天冬氨酸蛋白酶类如Cathepsin D、E。溶酶体水解酶同时参与机体的免疫、溶骨、细胞凋亡和中枢神经系统的成熟及发育等生理作用［16］。此外，它们还参与很多病理过程，例如在人体肿瘤中发现Cathepsin B上调［16］。

本研究结果提示，在小鼠成肌细胞C2C12体外培养模型中，布比卡因不改变溶酶体腔pH，但布比卡因组LAMP-1与Cathepsin B表达量均较对照组显著升高。由此表明，布比卡因不影响溶酶体腔pH，但是能增加溶酶体含量、增强溶酶体活性。

本研究初步发现布比卡因所致肌毒性与溶酶体的关系，但具体机制尚不明确。下一步研究工作将重点阐明自噬溶酶体途径在局部麻醉药肌毒性中的作用。

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