替加环素、米诺环素、多黏菌素B对碳青霉烯类敏感性降低和不敏感肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性

何建新 吴荣辉 金小珍

替加环素、米诺环素、多黏菌素B对碳青霉烯类敏感性降低和不敏感肺炎克雷伯菌的体外抗菌活性

何建新 吴荣辉 金小珍

目的 评价替加环素、米诺环素、多黏菌素B等对碳青霉烯类抗生素敏感性降低肺炎克雷伯菌（CDSKp）和碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌（CNSKp）体外抗菌活性，为临床治疗该类菌感染提供依据。方法 采用琼脂稀释法检测替加环素、米诺环素、多黏菌素B等抗生素对临床分离51株CDSKp和101株CNSKp的最低抑菌浓度（MIC）。结果 多黏菌素B对CDSKp和CNSKp体外抗菌活性最高，细菌对其均100%敏感，MIC50和MIC90均为0.125mg/L和0.25mg/L；替加环素MIC50均为1mg/L，MIC90均为2mg/L；米诺环素MIC50均为4mg/L，MIC90分别为4mg/L和8mg/L。 结论 多黏菌素B、替加环素和米诺环素对CDSKp和CNSKp具有较强的体外抗菌活性。

肺炎克雷伯菌 碳青霉烯类抗生素 最低抑菌浓度

肺炎克雷伯菌是临床分离的常见细菌，可引起肺炎、尿路感染、败血症、伤口感染、脑膜炎等多种疾病。由于近年来各种抗生素的广泛使用，对多种药物耐药的肺炎克雷伯菌菌株不断出现。近年来国内外报道，原来治疗产超广谱β-内酰胺酶（extended-spectrumβ-lactamases，ESBLs）肺炎克雷伯菌的碳青霉烯类药物，也正在渐渐失去功效，临床不断出现对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌多种感染[1]，给临床抗感染治疗造成了极大挑战。替加环素和米诺环素在我国新近上市，已用于治疗此菌引起的感染。为指导临床合理用药，笔者检测了替加环素、米诺环素、多黏菌素B等抗生素对临床分离的51株碳青霉烯类抗生素敏感性降低肺炎克雷伯菌（carbapenems-decreased Klebsiella pneumoniae，CDSKp）和101株碳青霉烯不敏感肺炎克雷伯菌（carbapenemsnonsusceptibility Klebsiella pneumoniae，CNSKp）的体外抗菌活性，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集本院2008年1月至2014年11月从呼吸道（痰液、灌洗液）、非呼吸道（血液、胸腹水、胆汁、导管、尿、脓、伤口分泌物）等各类临床送检标本8 929份中分离出的肺炎克雷伯菌2 415株作为受试菌，排除同一例患者重复菌株。细菌的分离培养按照全国临床检验操作规程第3版进行，细菌均经BD Phokenix100全自动细菌鉴定仪（美国BD公司产品）统一进行鉴定。

1.2 抗生素及培养基 替加环素购自江苏惠氏制药有限公司；多黏菌素B购自美国Sigma公司；米诺环素购自江苏惠氏制药有限公司；厄他培南、亚胺培南（IPM）、美罗培南（MEM）药敏纸片及EDTA均购自中国药品生物制品鉴定所。MH琼脂购自英国OXOID公司。

1.3 CDSKp和CNSKp初筛试验[2]使用无菌0.9%氯化钠溶液将分离菌调制成0.5麦氏单位菌悬液，用无菌棉拭子点种（接种面积为直径10～15mm圆形区域）至预先配制含美罗培南0.5mg/L的MH琼脂平皿，37℃空气孵育24h观察结果，含药平皿上生长1个以上受试菌菌落视为可疑CDSKp或CNSKp菌株。受试菌株纳入标准：美罗培南和亚胺培南最小抑菌浓度（MIC）=2mg/L为CDSKp；美罗培南或亚胺培南MIC≥4mg/L为CNSKp。1.4 药敏试验 将上述可疑CDSKp或CNSKp菌株进行药敏试验，药敏试验采用琼脂稀释法[4]。以大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853药敏试验质控菌，结果按临床实验室标准化协会（CLSI）标准进行判定耐药（R）、中介（I）和敏感（S）。替加环素药敏折点参考美国FDA标准，以MIC≤2mg/L为敏感，MIC≥8mg/L为耐药[3]。多黏菌素B药敏折点参照文献[4]。

1.5 改良Hodge试验 对收集的CDSKp和CNSKp菌株采用改良CLSI推荐的改良Hodge试验表型筛查是产生碳青霉烯酶[5]。

1.6 厄他培南/EDTA双纸片协同试验 采用厄他培南/ EDTA双纸片协同试验检测CDSKp和CNSKp菌株是否产金属β-内酰胺酶。即以无菌0.9%氯化钠溶液制备0.5麦氏单位浓度大肠埃希菌ATCC25922菌悬液（指示菌），并用0.9%氯化钠溶液进行了1∶10稀释，用无菌棉签将稀释后的菌液均匀涂布于MH琼脂平板上，干燥3~10min，将厄他培南纸片贴在涂抹了指示菌株的MH琼脂平板上。挑取血平板过夜生长的待测菌株3~5个菌落，从纸片边缘向外划直线20~25mm，37℃过夜培养16~20h后观察结果。若在厄他培南抑菌圈与待测菌株划线交叉处出现向抑菌圈内增强生长的现象即为阳性，否则为阴性。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件，敏感率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 CDSKp或CNSKp菌株初筛结果 2 415株肺炎克雷伯菌检出CDSKp和CNSKp菌株共计152株，检出率6.29%；经琼脂稀释法药敏试验验证，CDSKp 51株，检出率为2.07%；CNSKp 101株，检出率为4.18%。

2.2 CDSKp或CNSKp菌株对多黏菌素B、替加环素和米诺环素的敏感性 多黏菌素B对CDSKp和CNSKp体外抗菌活性最高，MIC50和MIC90分别为0.125和0.25mg/L，细菌对其敏感率均100%；其次是替加环素，MIC50均为1mg/L，MIC90均为2mg/L；对米诺环素MIC50均为 4mg/L，MIC90分别为 4mg/L和 8mg/L。CDSKp和CNSKp菌株对3种抗生素的药敏试验结果见表1。

表1 CDSKp和CNSKp菌株对3种抗生素的敏感性

2.3 CDSKp和CNSKp表型筛查及确证结果 CDSKp和CNSKp改良Hodge试验、金属β-内酰胺酶（厄他培南/EDTA双纸片协同试验），结果显示，CDSKp改良Hodge试验、金属β-内酰胺酶试验的阳性率均低于CNSKp，详见表2。

表2 碳青霉烯酶表型筛查及确证试验结果

3 讨论

目前，在全球范围内广泛报道的耐碳青霉烯肠杆菌科细菌可以引起医院内和社区感染的散发流行及暴发流行，已经成为全球面临的重要公共卫生问题，给临床抗感染治疗带来极大的挑战[6]。肺炎克雷伯菌为院内感染分离率较高的病原菌，其对碳青霉烯类药物的耐药率不断升高[7]。本研究从2008-2014年分离的2 415株肺炎克雷伯菌中检出CDSKp和CNSKp菌株共计152株，检出率6.29%。有文献报道，多数碳青霉烯敏感性降低和不敏感肺炎克雷伯菌系产KPC-2型，其次是产AmpC酶和（或）ESBLs，产金属酶也比较常见[8]。本文结果显示，CDSKp和CNSKp改良Hodge试验阳性度分别为78.43%和84.16%，金属β-内酰胺酶阳性率分别为5.88%和7.92%，和上述文献相一致。因此，治疗肺炎克雷伯菌感染时，应根据药敏结果选择敏感性高的抗生素，严格执行无菌操作以降低医院的交叉感染、防止和减少耐药株的产生和流行。

本研究发现碳青霉烯敏感性降低和不敏感肺炎克雷伯菌对多黏菌素B敏感率为100%，其MIC50和MIC90分别为0.125mg/L和0.25mg/L，显示其极强的体外抗菌活性，但多黏菌素B为快速杀菌剂，主要作用于细菌的细胞膜，有明显的肾毒性和神经毒性，药物不良反应发生率可达25%，在面对临床耐碳青霉烯革兰阴性菌和多药耐药革兰阴性菌感染时，被作为最后的抗感染药物应用于临床[9]。因此，在治疗过程中，除了应掌握使用剂量外，还应不断监测其可能发生的不良反应。另外，替加环素是米诺环素的衍生物，是第1个应用于临床的新型甘氨酸环素类抗生素，2005年FDA已批准的适应证包括：复杂性皮肤和皮肤软组织感染、复杂性腹腔内感染、社区获得性细菌性肺炎。研究表明，替加环素作用机制是以阳离子-四环素类复合物形式通过主动转运机制穿过细菌外膜并聚积在包膜间质，接着复合物解离，具有弱亲和脂性、电中性的四环素分子通过弥散方式透过细胞膜进入细胞[10]。一旦进入细胞质，四环素很可能与阳离子形成螯合物，并与核糖体30S亚基结合，阻断氨酰基-转移RNA（t-RNA）进入A位点，从而阻断肽链的延长继而抑制细菌蛋白质的合成。四环素类和甘氨酰环素类共享一个核糖体结合位点，该位点位于16SrRNA的30S亚基上。替加环素与核糖体结合的紧密度为四环素和米诺环素的5倍。替加环素也可能通过另外的结合位点，使其对核糖体保护介导的耐药菌仍保持活性。本研究结果显示，CDSKp和CNSKp对替加环素敏感率分别为92.16%和95.05%，与多黏菌素B相比，两者药物敏感性差异无统计学意义（P＞0.05），均明显高于米诺环素（均P＜0.05）；虽然如此，但还有70%以上的CDSKp和CNSKp对米诺环素保持敏感或中介，则提示替加环素治疗该菌感染时优于米诺环素，但两者均可作为治疗该类菌感染的选用药物。本研究还发现，米诺环素对CDSKp和CNSKp MIC50相同，MIC90分别为4mg/L和8mg/L，而前者敏感率（52.94%）低于后者（60.39%），原因可能是两者对米诺环素的耐药机制不同所致，尚需要进一步研究。

总之，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素耐药性在我院日趋严重，虽然多黏菌素B、替加环素和米诺环素对碳青霉烯类抗生素敏感性降低和不敏感肺炎克雷伯菌依然具有较强的体外抗菌活性，但加强肺炎克雷伯菌耐药性监测，积极采取有效措施控制耐药菌的播散已刻不容缓。

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Effects of tigecycline,minocycline and polymyxin B against Klebsiella pneumonia with decreased or no susceptibility to carbapenems in vitro

HE Jianxin,WU Ronghui,JIN Xiaozhen.Department of Clinical Laboratory，Yiwu Central Hospital，Yiwu 322000,China

Klebsiella pneumoniae Carbapenem Minimum inhibitory concentration

2014-09-19）

（本文编辑：严玮雯）

义乌市医学重点学科建设项目资助（13-ZD050）

322000义乌市中心医院检验科

吴荣辉，E-mail：w rh056@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the effects of tigecycline,minocyc line and polymyxin B against Klebsiella pneumoniae with decreased or no susceptibility to carbapenems in vitro. Methods Clinical strains of Klebsiella pneumoniae were collected in Yiwu Central Hospital during the period of 2008 to 2014,including 51 strains with decreased susceptibility to carbapenems and 101 non-susceptible strains.Agar dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentrations(MICs)of tigecycline,minocycline and polymyxin B against Klebsiella pneumonia.The data were analyzed by Windows software SPSS 16.0. Results Polymyxin B showed the highest activity against K.pneumonia strains with decreased or no susceptibility to carbapenems,and all the strains were susceptible to polymyxin B invitro with a MIC 50 and MIC90 value of 0.125mg/L and 0.25mg/L,respectively.The MIC50 and MIC90 values for tigecycline were 1mg/L and 2mg/L,respectively;those for minocycline were 4mg/L and 8mg/L,respectively. Conclusion Tigecycline,minocycline and polymyxin B have relatively higherantibacterialac tivity againstK.pneumonia strains with decreased or no susceptibility to carbapenems.