miRNA-133b在胃癌组织中的表达及临床意义

武伟 周洪伟 李国兰 何桦波

miRNA-133b在胃癌组织中的表达及临床意义

武伟 周洪伟 李国兰 何桦波

目的 分析miRNA-133b表达水平的改变与胃癌临床病理特征之间的关系，探讨miRNA-133b在胃组织中表达的意义。方法 选择手术治疗的胃癌患者肿瘤组织63例为研究对象，取切缘正常胃黏膜为对照，设计针对miRNA-133b的特异性引物，应用定量PCR方法检测胃癌组织中miRNA-133b表达水平的变化。结合临床病理资料对miRNA-133b的表达水平与肿瘤病理类型及临床病理分期之间的关系进行分析。检测胃癌细胞株中miRNA-133b的表达水平变化。结果 miRNA-133b在胃癌组织中表达水平明显低于正常胃黏膜组织[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下调≥2.0倍，占71%；6例上调≥2.0倍，占10%；12例无明显变化，占19%。miRNA-133b与肿瘤病理类型、肿瘤TNM分期无明显相关性（P＞0.05）。与正常胃黏膜细胞相比，在胃癌细胞株中miRNA-133b表达明显下调（P＜0.05）。 结论 在胃癌组织及胃癌细胞中，miRNA-133b的表达水平均有不同程度的降低，但其下降程度和比例与临床特征无明显相关性。miRNA-133b的表达水平下调可能与促进肿瘤细胞增殖有关。

miRNA-133b 胃癌 定量PCR

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，全球每年胃癌新发病例近百万，我国每年新发现40万胃癌患者，占世界胃癌发病人数的42%[1]。探讨胃癌的发病机制对胃癌的早期诊断和治疗至关重要。近年来，有研究证实了微小RNA（miRNA）在胃癌研究中的重要作用，miRNA是一种内源性单链非编码小RNA，长度约为16～28nt。miRNA在各种生长分化及生理过程中都有广泛的影响，参与基因组的稳定及后天修饰，调节新陈代谢及肿瘤的发生和转移[2]，目前已有研究表明miRNAs如 miRNA-21、miRNA-27a、miRNA-451、miRNA-143及miRNA-145等在胃癌发生、发展过程中发挥着重要的调控作用[3-6]，另外参考胃癌临床样本miRNA表达谱芯片检测结果，我们发现miRNA-133b在胃癌中表达明显下调[7]。本研究旨在观察miRNA-133b在胃癌组织和细胞中的表达及其在胃癌发生、发展中的调控作用，以加深对胃癌生物学特点的认识，探寻胃癌预防和治疗的新靶点。

1 资料和方法

1．1 一般资料 经杭州师范大学附属医院医学伦理委员会批准，患者本人或家属签署知情同意书，收集我院普外科2012年6月至2014年6月期间经胃癌根治术获得的新鲜标本共63例，经病理学诊断证实所得标本为胃癌组织。所有患者在手术前均未行放射治疗、化学治疗等，此次是首次进行胃癌根治术。按美国癌症联合会（AJCC）胃癌TNM分期（2010年第7版）标准分期将胃癌组织分为为Ⅱ期（13例），Ⅲ期（40例），Ⅳ期（10例）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及保存 肿瘤标本取自肿瘤部位，阴性对照标本取自距离肿瘤外缘5cm以外的正常胃黏膜组织。所有标本取下后立即放入液氮中，随后放在-80℃冰箱中保存。胃上皮细胞株GES-1和胃癌上皮细胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45由本实验室冻存，采用DMEM培养基，置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度的恒温培养箱中培养。

1.2.2 总RNA提纯 按Trizol试剂说明书，采用Trizol一步法提取组织和细胞中总RNA，使用ND-1000紫外/可见光分光光度计进行RNA质量和浓度鉴定。用琼脂电泳验证RNA的完整性。提取的RNA分装保存于-80℃超低温冰箱或立即用于逆转录。

1.2.3 实时定量PCR检测 以U6基因作内参，转录反应严格按照试剂盒说明书操作使用。实时荧光定量PCR仪（Rotor-Gene 3000，Corbett Research，AUS）和PCRmix试剂盒（QPK-201，TOYOBO）检测目的基因的表达水平。目的基因ΔCt=目的基因Ct值-内参基因的Ct值。引物序列见表1。

表1 miRNA-133b和U6的逆转录和PCR扩增引物序列

1.3 miRNA-133b表达水平与临床资料的相关分析 收集63例胃癌患者的基本人口学资料和相关临床资料，包括年龄、性别、肿瘤大小、病理分型、有无淋巴结转移等。根据以上资料对病例进行分组，比较miRNA-133b相对表达倍数在不同组间的差异。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料以或中位数表示，两组间比较采用t检验或Wilcoxon秩和检验，多组间比较采用单因素方差分析或Friedman M检验。

2 结果

2.1 miRNA-133b在人胃癌组织中及胃癌细胞株内表达明显降低 miRNA-133b在多数胃癌组织中表达水平明显低于癌旁组织[ΔCt：（-6.94±3.319）vs（-4.98±2.846），P＜0.001]。其中45例miRNA-133b下调≥2.0倍，占71%；6例上调≥2.0倍，占10%；12例无明显变化，占19%。此外，分别培养胃癌细胞株和正常胃黏膜细胞，并提取RNA，定量PCR检测miRNA-133b的表达水平，结果显示，miRNA-133b在胃癌细胞株内表达水平较胃正常上皮细胞内亦明显下降。在5个细胞株之间，BGC-823细胞中miRNA-133b表达水平最低，较GES-1细胞下降77．0%，AGS、HGC-27、MKN-28和MKN-45细胞中miRNA-133b表达水平与GES-1细胞比较，分别下降71.5%、68．3%、64．7%和50.8%（图1），该结果与胃癌组织标本中的检测结果一致，提示miRNA-133b表达水平与胃癌发生有紧密联系，miRNA-133b可能在胃癌发生、发展过程中发挥抑癌基因的作用。

图1 胃癌细胞株中miR-133b表达水平分析

2．2 miRNA-133b表达水平与临床资料的相关分析 63例胃癌患者中，与Ⅱ期胃癌相比，miRNA-133b表达水平在Ⅲ、Ⅳ期胃癌中也有较明显的下降趋势，但差异无统计学意义，其他特征如年龄、性别、肿瘤大小及病理分型等因素与miRNA-133b的表达水平无关（均P＞0．05），见表2。

3 讨论

miRNA-133家族包括miRNA-133a和miRNA-133b两个成员，miRNA-133a在基因组定位于第18号染色体，而miRNA-133b则定位于第6号染色体。PrimiRNA-133b是一个由119个碱基组成的发夹状前体，经过Drosha和Dicer酶的剪切，最终变成22nt成熟的miRNA。既往研究提示，miRNA-133a和miRNA-133b在小鼠肌肉发育过程中的表达水平明显升高，并且可促进其分化成熟[8]，被认为是“肌肉组织特定的miRNA”。然而新近的研究显示，miRNA-133b在正常人体组织中同样表达，而正常组织变成恶性肿瘤组织时，其表达水平又发生明显的改变。如在舌癌、膀胱癌、口腔上皮癌、肺癌、食管癌等[9-14]，miRNA-133b表达水平明显发生改变，并能影响肿瘤细胞的增殖。本研究中，我们在体内和体外水平对63例胃癌中心组织及配对癌旁正常组织和多个胃癌细胞株中的miRNA-133b进行相关检测，发现多数胃癌组织中miRNA-133b的表达水平低于癌旁组织。另外，我们检测了miRNA-133b在胃癌上皮细胞株AGS、BGC-823、HGC-27、MKN-28和MKN-45中的表达水平，结果发现与正常黏膜细胞株GES-1相比，miRNA-133b在胃癌细胞株表达水平也明显下调。因此，基于以上实验结果，说明无论在组织水平还是细胞水平，miRNA-133b的下调表达是一个普遍现象。

表2 胃癌病例临床特征与miR-133b表达水平的相关分析

进一步分析miRNA-133b的表达与胃癌的临床病理因素的相关性显示，miRNA-133b的表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小及胃癌的分化程度、淋巴结转移、TNM分期均无明显统计学相关性。因此在临床胃癌中，miRNA-133b表达水平下降的程度不能反应肿瘤的生物学行为，它不是一个理想的早期诊断及预测转移潜能的指标。然而由于本实验所用标本是近1~3年的手术切除标本，还缺乏长期跟踪随访的研究资料，因此我们尚不能确定miRNA-133b是否与肿瘤患者的预后相关。

本研究表明，miRNA-133b在胃癌组织及细胞中的表达普遍下调，由此可认为miRNA-133b在抑制胃癌发生、发展的某个或某些环节中发挥重要作用；而在胃癌发生、发展过程中的具体作用机制有待进一步研究阐述。

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Expression of miRNA-133b in gastric cancer and its clinical significance

WUWei，ZHOU Hongwei，LI Guolan，et al.Department of General Surgery，Affiliated Hospital,Hangzhou Normal University，Hangzhou 300015,China

miRNA-133b Gastric cance Quantitative real-time PCR

2015-05-26）

（本文编辑：严玮雯）

310015杭州师范大学附属医院普外科

【 Abstract】 Objective To investigate the exp ression of miR-133b in gastric cancer and its c linicopathological significance. Methods Sixty three specimens of p rimary gastric cancer and corresponding pericancerous gastric tissue were collected.The level of miRNA-133b was exam ined using quantitative real-time PCR assay(qPCR);the correlation between miRNA-133b level and c linicopathologic features were analyzed.The exp ression ofmiR-133b in 5 human gastric cancer cell lines was also exam ined by qPCR.Results Themean exp ression levelofmiRNA-133b was down-regulated in gastric cancer tissues compared with the ad jacent tissues[ΔCt:(-6.94±3.319)vs(-4.98±2.846),P＜0.001].Among 63 pairs gastric cancer tissues,45 cases showed down-regulation of miRNA-133b＞2 folds,12 cases had no d ifference,6 cases d isp layed up-regulation＞2 folds.No significantassociations were detected between the levelofmiRNA-133b exp ression and TNM stage in gastric cancer(P＞0.05).miRNA-133b was also marked ly down-regulated in gastric cancer cell lines. Conclusion miRNA-133b exp ression is down-regulated in gastric cancer tissue and human gastric cell lines.There is no association of miRNA-133b exp ression w ith TNM staging.