当归补血汤对高糖条件下系膜细胞Nrf2表达及T-SOD、MDA的影响

任小旦，张莹雯，王秀萍，郑保根

(武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)

当归补血汤对高糖条件下系膜细胞Nrf2表达及T-SOD、MDA的影响

任小旦，张莹雯，王秀萍，郑保根

(武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071)

[摘要]目的 研究当归补血汤对高糖条件下大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)核因子相关因子2(Nrf2)表达及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量的影响，探讨其在糖尿病肾病(DN)治疗中的作用机制。方法 将60只大鼠分为正常组、高糖组、当归补血汤高剂量组[7 g/(kg·d)]、当归补血汤中剂量组[3.5 g/(kg·d)]、当归补血汤低剂量组[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特组[(2 mg/kg·d)]，每组10只。应用RT-PCR法检测各组GMCs的Nrf2 mRNA表达情况，Western blot法检测各组GMCs的Nrf2蛋白表达情况，应用黄嘌呤氧化酶法检测各组GMCs培养上清液的T-SOD活性，应用硫代巴比妥酸法检测各组GMCs培养上清液的MDA含量。结果 正常组Nrf2 mRNA和蛋白有一定量的表达，高糖组和正常组相比Nrf2 mRNA和蛋白表达均增加，当归补血汤高剂量组对高糖条件下系膜细胞Nrf2 mRNA和蛋白表达均有明显上调作用(P均<0.01)；与正常组相比，高糖组T-SOD活性明显降低(P<0.01)，MDA含量明显增多(P<0.01)，而当归补血汤各剂量组能提高T-SOD的活性，抑制高糖条件下MDA的过多生成，尤其以高剂量组最为明显(P<0.01)。结论 当归补血汤能上调高糖条件下系膜细胞Nrf2的表达，提高T-SOD的活性，抑制MDA的过多生成，从而抵抗高糖诱导的氧化应激反应，保护系膜细胞。

当归补血汤；系膜细胞；Nrf2；T-SOD；MDA

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN) 是糖尿病(diabetes mellitus,DM)引起的危害性最大的慢性微血管并发症，已成为导致终末期肾病(end stage renal disease,ESRD)的主要原因[1]。近年研究表明，氧化应激在 DN 的病理改变中发挥关键作用[2-3]。核因子相关因子2(Nrf2)是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，维持细胞内氧化还原平衡的重要转录因子[4]，因此在细胞的抗氧化应激过程中发挥重要作用，在糖尿病及其并发症的研究中也成了一个重要的靶点。超氧化物歧化酶(SOD)的活性反映了细胞内清除氧自由基即抗氧化的能力；丙二醛(MDA)是机体自由基作用于生物膜多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的终产物，MDA的含量可反映脂质过氧化的程度,间接反映细胞受损情况和氧自由基水平。SOD和MDA是衡量机体氧自由基基础代谢状态的主要指标。糖尿病肾病属于祖国传统医学“消渴”中“下消”的范畴，临床治疗多采用补气养阴生血、活血化瘀等中药治疗。当归补血汤由补气的黄芪和活血的当归组成，具有补气生血活血功效，正契合DN的病因病机。肾小球系膜细胞(GMCs)是DN的各种致病因子作用的主要靶细胞，因此本实验旨在通过血清药理学研究，探讨当归补血汤对高糖条件下GMCs的Nrf2表达及T-SOD、MDA的影响，从而为当归补血汤用于治疗DN提供理论依据。

1 实验资料

1.1材料及试剂

1.1.1实验动物和细胞 60只SPF级SD成年雄性大鼠,体质量180～200 g,4～6周龄,由武汉大学动物实验中心提供,合格证号:[SCXK(鄂)2003-0004]。大鼠GMCs株(HBZY-1，购自武汉大学典藏中心)。

1.1.2实验药材、试剂和仪器 当归补血汤(黄芪∶当归=5∶1，由武汉大学中南医院中药房提供，用自来水将中药浸泡30 min后分煎2次混匀，浓缩至2 kg/L药液， 冷却后装瓶放冰箱备用)； 格列奇特(法国施维雅药厂，批号: 2005883)；RPM I 1640培养基，美国Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，Gibco公司；超净工作台,苏州净化;37 ℃ 5% CO2恒温饱和湿度培养箱,美国Thermo Forma公司；紫外分光光度计，BIO-RAD公司；T-SOD和MDA检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，ASPEN公司；电泳仪，北京六一仪器厂，型号：DYY-6C；兔抗鼠单克隆Nrf2抗体(一抗)，CST公司，目录号#8882S；HRP标记的山羊抗兔(二抗)，KPL公司，目录号074-1506；Trizol,MRC公司；SYBR GreenⅠ荧光染料,晶赛公司；BIO-RAD CFX Connect荧光定量PCR检测系统。

1.2实验方法

1.2.1含药血清的制备 60只SPF级SD成年雄性大鼠随机分为正常组、高糖组、当归补血汤高剂量组[7 g/(kg·d)]、当归补血汤中剂量组[3.5 g/(kg·d)]、当归补血汤低剂量组[1.75 g/(kg·d)]、格列奇特组[2 mg/(kg·d)]，每组10只，每日定时灌胃，各组药物按大鼠与人等效剂量折算。正常组、高糖组不给药，每日灌等量生理盐水,每日1次,连续7 d。于末次灌胃2 h后经腹主动脉采血，离心取血清，56 ℃水浴30 min灭活处理后，经0.22 μm孔径的针头滤器过滤除菌，分装冻存备用。

1.2.2细胞实验分组 正常组(5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇+20%FBS)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖+20% FBS)、当归补血汤高剂量组(10%当归补血汤高剂量含药血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、当归补血汤中剂量组(10%当归补血汤中剂量含药血清+30 mmol/L葡萄糖+10%FBS)、当归补血汤低剂量组(10%当归补血汤低剂量含药血清+30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)、格列齐特组(10%格列齐特含药血清加30 mmol/L葡萄糖+10% FBS)。

1.2.3肾小球系膜细胞上清液的收集 取传代培养的肾小球系膜细胞,吸去培养液,用PBS洗涤培养瓶2次,然后加0.25%胰蛋白酶,放入细胞培养箱中,37 ℃消化数分钟后加入含20% FBS 1640液5 mL终止消化,4 ℃、1 000 r/min离心5 min,弃去上清,加入培养液以1×104/孔接种于48孔培养板中,常规培养24 h,使细胞贴壁。后更换无血清1640培养基,继续培养24 h使细胞同步于G0/G1期,吸弃培养板内培养液,按1.2.2实验分组加入各自不同条件培养液,继续培养24 h,终止培养,离心2 000 r/min,10 min后取上清,收集培养上清液分装,-70℃低温冰箱保存。

1.2.4RT-PCR检测各组GMCs的Nrf2的mRNA表达量 收集培养72 h的各组细胞，0.01 mol/L PBS洗各组细胞,按Trizol说明书提取细胞总RNA。按cDNA逆转录试剂盒说明逆转录RNA合成cDNA后，采用BIO-RAD CFX Connect荧光定量PCR检测仪进行扩增。扩增条件为:94 ℃ 2 min后,进行40个循环:94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s(监测荧光信号);反应完成后于16 ℃保存。采用β-actin为内参。引物和内参序列如下：Nrf2上游为5’-TGTCAGCTACTCCCAGGTTG-3’，下游为5’-ATCAGGGGTGGTGAAGACTG-3’；β-actin上游为5’-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3’，下游为5’-ATGGAGCCACCGATCCACA-3’。目的基因扩增用Ct值,应用ΔΔCT法进行定量分析。ΔCT(目的基因)=CT目的基因-CT内对照基因,ΔΔCT=ΔCT目的基因-ΔCT标准值,使用2-ΔΔCT计算基因表达情况。

1.2.5Western blot检测各组GMCs的Nrf2蛋白表达量 提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度;配制SDS-PAGE胶，取等量蛋白电泳，转膜3 h，将膜置于5%的脱脂奶粉中，室温轻摇封闭1 h，加入兔抗鼠单克隆Nrf2一抗(1∶1 000)，4 ℃轻摇过夜,TBST漂洗3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1∶10 000)，室温轻摇2 h，TBST漂洗，化学法发光，曝光，显影，定影后获得相应蛋白条带底片，将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

1.2.6各组GMCs上清液T-SOD活性和MDA含量检测采用黄嘌呤氧化酶法检测各组GMCs培养上清液的总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。采用硫代巴比妥酸法检测各组GMCs培养上清液的MDA含量。严格按照说明书操作步骤进行操作。

1.3统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，若方差齐，组间比较采用单因素方差分析；若方差不齐，采用Kruskal-Wallis秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组GMCs的Nrf2的mRNA表达情况 Nrf2 mRNA在正常组细胞中有一定量的表达，高糖组Nrf2 mRNA表达量高于正常组(P<0.05)。当归补血汤中剂量组、高剂量组及格列齐特组Nrf2 mRNA表达量均明显高于高糖组(P均<0.05)。当归补血汤中剂量组和格列齐特组比较差异无统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 各组RMCs的Nrf2的mRNA相对表达量

2.2各组GMCs的Nrf2蛋白表达情况 高糖组细胞Nrf2蛋白表达量明显高于正常组(P<0.01)，当归补血汤中剂量组、高剂量组及格列齐特组Nrf2蛋白表达量明显高于高糖组(P均<0.01)。当归补血汤高剂量组和格列齐特组比较差异无统计学意义。见图2及图3。

图2 Wertern blot检测各组Nrf2蛋白表达情况

图3 各组RMCs的Nrf2的蛋白相对表达量

2.3各组GMCs上清液T-SOD活性 高糖组细胞上清液T-SOD活性显著低于对照组(P<0.01)，当归补血汤各剂量组及格列齐特组T-SOD活性明显高于高糖组(P均<0.01)。当归补血汤高剂量组和格列齐特组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4 各组RMCs的上清液T-SOD活性

2.4各组GMCs上清液MDA含量 高糖组细胞上清液MDA的含量显著高于正常组(P<0.01)，当归补血汤中剂量组、高剂量组及格列齐特组MDA含量明显低于高糖组(P均<0.01)。当归补血汤高剂量组与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)，与格列齐特组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图5 各组RMCs的上清液MDA含量

3 讨 论

糖尿病是目前对人类影响最大的代谢性疾病，其并发症也很多，其中20%～40%会发生DN。DN是糖尿病常见的难治性微血管并发症,其中约40%的DN会进展成ESRD[5]。DN早期特征性的病理学改变有肾小球肥大、增殖，细胞外基质(ECM)大量积聚,肾小球基底膜增厚，最终导致肾小球硬化和肾小管间质弥漫性纤维化。系膜细胞是肾小球的固有细胞，对维持肾小球结构和功能的动态稳定性有重要作用，同时为肾小球毛细血管襻调节肾小球滤过提供结构保障[6]，在DN的发病过程中有重要作用。

氧化应激已被公认为是DN发病机制中十分重要的环节。核转录因子Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子,是细胞抗氧化还原的中枢调节者[7]。目前研究证实,肾组织活性氧族(reactive oxygen species,ROS)过度蓄积是导致糖尿病肾损害的重要原因。有研究表明，高糖可刺激机体系膜细胞产生大量的ROS及大量表达的Nrf2，且两者的改变相一致，提示正常情况下，Nrf2的表达与氧化应激的程度相平行，以维持机体内氧化还原状态的平衡[8]。正常状态下，Nrf2位于细胞质中，在与其抑制蛋白Keapl相互作用后降解、失活。 在机体受到活性氧或亲核物质的刺激时，胞质中的Nrf2就会与Keapl解离，发生去泛素化，并进入细胞核。在胞核内，Nrf2结合其他的bz-IP蛋白形成异二聚体后，与抗氧化反应元件ARE靶向结合使ARE相关的抗氧化酶基因的表达上调，启动Nrf2下游靶基因包括过氧化氢酶(CAT)、SOD、谷胱甘肽硫转移酶(GST)、血红素加氧酶(HO-1)等表达[9-11]。

当归补血汤是中国传统医学的经典方，方中黄芪味甘、温，具有益气固表、补气升阳等作用；当归味甘、辛温，能补血生血，气轻而辛，又能行血。近年有关当归补血汤对肾功能保护作用的研究有众多报道，如魏明刚等[12]、赵红心等[13]分别从动物实验和临床观察中发现当归补血汤对DN有明显的治疗作用。周必发等[14]研究发现当归补血汤能够明显抑制高糖条件下GMC增殖及其细胞中NF-κB蛋白表达的增加,从而发挥预防和治疗肾小球硬化作用,进而延缓DN的进展。本实验研究结果发现，当归补血汤能上调高糖条件下Nrf2的表达，无论是从蛋白层面还是从基因层面上均证实了这一点，尤其在高剂量组尤为明显。大量研究表明，Nrf2及其下游通路可以对抗氧化应激导致的肾脏细胞损伤[8，15-16]，而当归补血汤具有上调Nrf2表达的作用，因而具有抗氧化应激的功效。本研究还发现，高糖条件下各组系膜细胞经当归补血汤含药血清干预后上清中MDA含量均有所下降，而SOD总活性均有所上升，高剂量组尤为明显，对MDA的调节作用甚至优于格列奇特。由于MDA含量是直接反映脂质过氧化的程度，而SOD活性是间接反映O2-的产生量，而氧化应激本就是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加和/或清除能力降低[17]，因此，这些结果更进一步支持了上述结论。

综上所述，经典的补气生血方当归补血汤能上调高糖条件下系膜细胞Nrf2的表达，提高T-SOD的活性，抑制MDA的过多生成，抵抗高糖诱导的氧化应激反应，保护系膜细胞，其上述调节作用在某些方面甚至优于西药格列奇特。但当归补血汤上调Nrf2表达、提高T-SOD活性、抑制MDA过多生成的具体信号传导通路及其机制还有待于进一步深入研究。

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Effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD, MDA in high glucose condition

REN Xiaodan，ZHANG Yingwen，WANG Xiuping，ZHENG Baogen

(Zhongnan Hospital of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China)

Objective It is to observe the effects of Danggui Buxue decoction on glomerular mesangial cell Nrf2 expression and T-SOD activity, MDA content in high glucose condition,and to explore its treatment significance in the process of diabetic nephropathy (DN). Methods Sixty rats were randomly divided into normal group, high glucose group, high, medium and low dose of Danggui Buxue decoction groups [7 g/(kg·d), 3.5 g/(kg·d),1.75 g/(kg·d)respectively], Gliclazide group[2 mg/(kg·d)], each group had 10 rats. RT-PCR was used to detect expression of Nrf2 mRNA and Western blot used to detect expression of Nrf2 protein of GMCs in each group；Xanthine Oxidase assay was used to detect T-SOD activity and Thiobarbituric Acid method was used to detect MDA content in cell supernatant of GMCs in each group. Results Both of Nrf2 mRNA and protein in normal group had a certain amount of expression；Nrf2 mRNA (P<0.05) and protein (P<0.01) were both increased in high glucose group compared with normal group. High-dose group has a significantly upregulation effect on Nrf2 mRNA and protein expression of GMCs in high glucose condition(P<0.01). Compared with the normal group, T-SOD activity of high glucose group was significantly decreased (P<0.01), MDA content was significantly increased (P<0.01)；while SOD activity was improved, MDA production in high glucose condition was inhibited in every Dangui Buxue decoction group, especially in the high dose group (P<0.01). Conclusion Danggui Buxue decoction could upregulate the expression of Nrf2 mRNA and protein，improve SOD activity，inhibit MDA excessive generation of GMCs in high glucose condition, thereby resisting oxidative stress induced by high glucose and protecting mesangial cells.

Dangui Buxue decoction；glomerular mesangial cells；Nrf2；T-SOD；MDA

任小旦，男，硕士研究生，研究方向为中西医结合内分泌。

张莹雯，E-mail ：hhao3838@sina.com

国家自然科学基金资助项目(81373793)

10.3969/j.issn.1008-8849.2015.26.002

R-33

A

1008-8849(2015)26-2855-04

2015-05-10