白藜芦醇促TRAIL诱导PC—3细胞凋亡的作用

李小翠+尤红娟+李向阳+华慧+汤仁仙

[摘要] 目的 研究白藜芦醇（Res）促进肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白诱导人前列腺癌细胞PC-3凋亡的作用。 方法 实验分为TRAIL蛋白组以及联合应用白藜芦醇和TRAIL蛋白的联合用药组；采用CCK8法检测细胞增殖情况，确定白藜芦醇的用药浓度；通过CCK8法、流式细胞术检测TRAIL蛋白组、联合用药组细胞增殖和凋亡情况；分光光度法检测两组细胞caspase-8、caspase-3活性。 结果 CCK8结果提示白藜芦醇的用药浓度为50 μmol/L；联合用药组PC-3细胞的增殖率明显低于TRAIL蛋白组（P<0.05）；流式细胞术检测结果显示，联合用药组PC-3细胞的凋亡率明显高于TRAIL蛋白组（P<0.05）；caspase活性检测结果显示，联合用药组PC-3细胞caspase-8、caspase-3的活性明显高于TRAIL蛋白组（P<0.05）。 结论 白藜芦醇能够促进TRAIL蛋白诱导的PC-3细胞凋亡，为肿瘤的生物学治疗提供新的材料。

[关键词] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；白藜芦醇；PC-3；凋亡

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）12（c）-0008-04

前列腺癌是严重威胁男性健康的肿瘤之一，发病率居世界肿瘤第六位。虽然内分泌治疗可以使大多数患者的病情得到控制和改善，但绝大多数患者会发展为激素抵抗性前列腺癌，患者生存率较低。因此，寻找有效的治疗手段延长此类患者的生存期，成为目前前列腺癌治疗的有效途径。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）属于肿瘤坏死因子超家族成员，能够高特异性地诱导肿瘤细胞的凋亡，且对正常组织细胞没有作用[1-4]，因而成为肿瘤生物学治疗新的热点。白藜芦醇（Resveratroi，Res）属多酚类化合物，研究发现，其不仅具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗氧化等作用，还可抑制乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤细胞的生长[5-9]。本实验利用人前列腺癌细胞PC-3，观察联合应用Res和TRAIL蛋白对PC-3细胞的凋亡情况，证实Res能够促进TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人前列腺癌细胞PC-3购自上海中科院细胞库；Res购自天津迈迪瑞康公司；重组人TRAIL蛋白购自TEPROTEH公司；AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒购自天根生物公司；CCK8检测试剂盒购自碧云天公司；caspase-8、caspase-3活性检测试剂盒购自碧云天公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 CCK8检测细胞增殖情况 将处于对数生长期的PC-3细胞以5×104/ml接种于96孔板，首先确定Res的用药浓度，分别加入Res，浓度为12.5、25、50、100 μmol/L；TRAIL蛋白组每孔加入TRAIL蛋白，浓度分别为25、50、100、200 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后，每孔再分别加入上述浓度TRAIL蛋白。于细胞培养箱培养24 h后，每孔分别加入CCK8试剂各10 μl，酶标仪检测OD值。以未处理的细胞作为正常组，以培养基作为空白组。细胞增殖率%=（实验组OD值-空白组OD值）/（正常组OD值-空白组OD值）×100%。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡情况 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，24 h后收集细胞，具体操作步骤按照AnnexinV/PI凋亡检测试剂盒说明书进行，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.3 caspase-8、caspase-3活性检测 将PC-3细胞以2×105/ml接种于6孔板，培养12 h后，单独应用TRAIL蛋白组加入TRAIL蛋白100 ng/ml；联合用药组加入Res 50 μmol/L后加入TRAIL蛋白100 ng/ml，12 h后收集细胞，分光光度法检测caspase-8和caspase-3活性，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，组间两两比较采用q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Res增强TRAIL蛋白对细胞增殖的抑制作用

Res组细胞CCK8实验结果显示，当Res浓度为50 μmol/L时，增殖率为（72.61±4.41）%，Res浓度为100 μmol/L时，增殖率为（70.16±3.73）%，较前差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。TRAIL蛋白组的实验结果显示，当TRAIL蛋白的浓度为100 ng/ml时，增殖率为（69.05±6.97）%，而TRAIL蛋白浓度200 ng/ml时，PC-3细胞的增殖率为（67.72±5.68）%，较前差异无统计学意义（P>0.05）。当TRAIL蛋白浓度为100 ng/ml时，联合用药组PC-3细胞增殖率为（38.70±2.43）%，与TRAIL蛋白组相比，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。结果表明，Res能够明显增强TRAIL蛋白对PC-3细胞增殖的抑制作用。

2.2 Res促进TRAIL蛋白诱导的凋亡作用

2.2.1 流式细胞术检测结果 TRAIL蛋白组PC-3细胞的凋亡率为（34.86±1.25）%，联合用药组PC-3细胞的凋亡率升高至（70.55±2.90）%，差异有统计学意义（P<0.05），说明Res可以增强TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用（图1）。

2.2.2 caspase-8、caspase-3活性检测试剂盒结果 TRAIL蛋白组caspase-8、caspase-3活性升高，联合用药组升高更明显，与TRAIL蛋白组相比，差异有统计学意义（P<0.05）（表3）。

3 讨论

前列腺癌为常见的恶性肿瘤，且发病率逐年上升，特别对晚期的前列腺癌目前缺少有效的治疗方法，因而，寻求新的治疗手段是目前急需解决的问题。应用有效药物促进肿瘤细胞凋亡是目前治疗肿瘤的重要途径之一，也是前列腺癌治疗的关键靶点。

TRAIL通过与细胞表面的TRAIL受体特异性结合发挥促凋亡作用[10-11]，但有些肿瘤细胞TRAIL受体表达量较低而限制了TRAIL蛋白的促凋亡作用的发挥，因而寻找和应用能够提高TRAIL蛋白促凋亡作用的药物使之能够更好地发挥抗肿瘤作用[12]，成为抗肿瘤治疗新的突破点。

Res的生物学作用非常广泛，除具有强大的抗炎、抗氧化作用外，还对肿瘤的发生发展有明显的抑制作用[13-17]，但具体机制尚不清楚，且由于Res具有雌激素样活性，因而在前列腺癌的治疗中备受关注。已有研究结果表明，Res能够促进TRAIL蛋白对人肝癌细胞的凋亡作用[18]，因此，本研究通过实验证实Res是否对TRAIL蛋白诱导的人前列腺癌细胞凋亡具有促进作用。

实验结果显示，Res能够抑制PC-3细胞的增殖，且存在剂量依赖，当Res浓度为50 μmol/L时，作用较为明显，浓度继续增高，对细胞的增殖抑制作用不再增加，因而选用50 μmol/L为联合用药组Res的用药浓度。TRAIL蛋白组的实验结果表明，随着TRAIL蛋白浓度增高，PC-3细胞的增殖率降低，在TRAIL蛋白浓度达到100 ng/ml后，对细胞增殖的抑制作用不再提高，因而联合用药组的TRAIL蛋白浓度选用100 ng/ml。在TRAIL蛋白浓度相同的情况下，联合用药组的细胞增殖率明显低于TRAIL蛋白组，说明Res能够加强TRAIL蛋白对细胞的增殖抑制作用。流式细胞术的检测结果同样显示，Res能够显著提高TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用。由于TRAIL蛋白是通过与死亡受体结合，活化caspase-8，继而引发caspase级联反应，最后激活下游凋亡执行分子caspase-3而引发凋亡[19-20]。因此，本实验进一步检测了caspase-8和caspase-3的活性，结果显示，与单独应用TRAIL蛋白相比，联合用药组caspase-8和caspase-3的活性明显升高，进一步证实Res可以提高TRAIL对PC-3细胞的凋亡作用，为前列腺癌的治疗提供了新的思路和实验基础。

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