蛋白质芯片技术的临床应用新进展*

谢林峰 向俊蓓 孙亚男 徐曾涛

近年来，随着基因组技术的不断完善以及基因组计划的发展，人类已经获得了包括人类自身在内的3173个物种的全部基因序列（Genome Online Database，http：//www.genomesonline.org），这为学者提供了巨量的遗传信息资源，推动着生命科学向着更加个性化、精确化以及规模化的方向发展，为人类认识生命、治疗疾病甚至改造生命奠定了基础。然而，基因只是携带遗传信息的DNA片段，由基因所表达出的蛋白质才具有执行生命活动的功能。因此，机体蛋白质的结构与功能以及蛋白质表达图谱的探究成为近年来生命科学领域的研究热点[1]。在1994年，Wilkins等提出蛋白质组的概念，它是指由一个基因组（Genome）或一个细胞、组织在特定的环境或状态下所表达的所有蛋白质。这个新概念的提出对蛋白质的研究具有革命性的意义。而后，随着人们对蛋白质组研究的不断深入，大规模、高通量的蛋白质分析成为必须，蛋白质芯片技术的发明与完善恰好解决了这个问题。蛋白质芯片技术又叫蛋白质微阵列，它是一门微电子、微机械、化学等与生命科学结合的新兴技术。其作为蛋白质组研究工具时所表现出的高通量、高灵敏度、高特异性、自动化、微型化等特点，具有比传统蛋白质组研究方法如二维凝胶电泳和酵母双杂交技术等更大的优越性[2]。如今，蛋白质芯片技术已经广泛应用于食品、生物、医学等领域的基础性研究当中，特别是在临床医学中，蛋白质芯片技术在肿瘤、传染性疾病以及自身免疫性疾病的早期诊断以及检测病原微生物与毒素等方面发挥着巨大的应用价值与潜能[3]。本文对蛋白质芯片技术的原理，分类与其在临床中的最新应用进展作一总结。

1 蛋白质芯片的原理

蛋白质芯片是把多种不同蛋白质高密度的固定在固相载体（玻璃、硝酸纤维素膜、硅片、PVDF膜等）的表面而形成的蛋白质微阵列。然后与酶、同位素或荧光素等活性物质标记的靶蛋白质分子进行杂交。待其结合到芯片表面介质后，通过质谱仪、电荷偶联照相系统及CCD扫描仪等检测芯片信号，然后用计算机分析软件对所获得的信号进行快速、准确的分析，最后得到大量的信息[4]。该芯片技术是在基因芯片后发展而起的后基因组研究芯片技术，弥补了基因芯片运用上的局限性。

2 蛋白质芯片的分类

蛋白质芯片的分类标准很多，其中以蛋白质芯片检测方法为标准可将其分为探针标记检测法芯片、无探针标记检测法芯片。荧光检测法属于探针标记检测法，因其具有安全、简易、灵敏度高等优点成为目前应用最广泛的检测方法。其次为非探针标记的检测方法。如SELDI蛋白质芯片技术，又称为表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface- enhanced laser desorption/ionization -time of flightmass spectrometry，SELDI-TOF-MS）。它的优点是防止蛋白质与探针相互结合后可能导致的某些蛋白质变性，从而提高检测结果的准确度。整个过程方便、快捷、准确率高。在蛋白表型的研究、生物标志物的寻找、药物研发，特别是在临床上对肿瘤的早期诊断上发挥着重要的作用[5]。

3 蛋白质芯片在临床上的应用

3.1 在肿瘤诊断中的应用 目前，对肿瘤的检测与诊断已经具有了一系列比较成熟的检测方法，比如生化检查、器械检查、免疫及遗传学检查等多种方法，然而对肿瘤早期的诊断以及受多种因素影响而未出现明显临床症状的疾病，这些方法往往表现出敏感性与特异性不高的缺点。另据统计分析表明，35%的结肠癌、50%的乳腺癌与56%的前列腺癌在转移之前无法用以上方法检出。可喜的是，蛋白质芯片技术的发展正好弥补了以上技术的不足，因其能高灵敏度地寻找到新的肿瘤标记物，所以在肿瘤的早期诊断与监测治疗效果中发挥着重要的作用，成为临床医学领域最前沿的研究技术之一。Lu等[6]利用SELDI-TOF-MS技术对胃癌患者与非胃癌人群血清标本进行检测，发现五个蛋白峰（m/z分别为2046、3179、1817、1725和1929）组成的诊断模型可以作为检测胃癌的最佳标志物。同时，单一的蛋白峰（m/z4665）的变化可以鉴别出一/二阶段的胃癌与三/四阶段的胃癌，其特异性达到91.6%，灵敏性达到95.4%；Wang等[7]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技术对结肠癌相关成纤维细胞与正常结肠间质成纤维细胞中的蛋白质表达量进行分析，结果发现在总细胞裂解物中，有4个蛋白峰（m/z分别为1142、3011、4035和4945）被检测到，在条件培养基中，两个蛋白峰（m/z为1368、1389）被检测到，这些蛋白质的改变在结肠癌微环境中起着重要的作用；Xu等[8]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技术检测大肠癌患者大肠组织中蛋白质指纹图谱，分析结果发现，通过筛选不同标志物建立诊断模型，由15个蛋白峰（m/z分别为3850、3570、3651、5012、3338、6618、3904、5224、2909、5208、3645、5034、3451、8424和3628）建立的诊断组织模型诊断大肠癌组织与正常组织的敏感性与特异性均达到100%，此技术有望成为一种具有高度敏感性的检测工具；Fan等[9]利用蛋白芯片SELDI-TOF-MS技术筛选出三个蛋白峰（m/z分别为6630、8139与8942）来构建高鉴别力的诊断模型用以诊断乳腺癌，其灵敏度与特异性分别达到96.45%与94.87%。Song等[10]建立了基于SELDI-TOF-MS技术的肺癌诊断模型，由4个蛋白峰（m/z分别为6445、9725、11 705与15 126）组成的诊断模型在鉴别肺癌患者与非肺癌者的灵敏度为93.3%（28/30），特异性为90.5%（57/63）；Liu等[11]利用蛋白芯片技术鉴别特异性胰腺癌个体与健康个体，其特异性与敏感性均为91.6%；Petricoin等[12]利用SELDI-TOF-MS技术检测了非卵巢癌人群与卵巢癌患者的血清标本，结果发现其中五个蛋白质峰（m/z分别为534、989、2111、2251、2465）同时发生变化，与传统的卵巢癌标志物CA125相比，由它们组成的蛋白质指纹图谱检测早期卵巢癌的阳性预测值提高到94%，特异性为95%，敏度达到100%。因此，在卵巢癌的早期诊断中发挥着非常重要的意义。

3.2 在传染性疾病研究中的应用 现如今，对传染性疾病的检测已经有一套成熟的体系与检测方法，并取得了良好的效果。同时，蛋白质芯片技术作为一种新开发出的优越的蛋白质分析技术，其在检测传染病病原体、研究其毒力、致病与耐药机制等方面发挥着重要的作用。例如感染HIV的患者，联合感染HBV或HCV的情况较为常见，传统的检测方法操作步骤较繁琐，敏感度较低。Xu等[13]开发出了一种蛋白质芯片，它能够同时检测感染者血清中的HBV、HCV、HDV、HEV与HGV的相应的抗体，大大减少了血清样品的用量，提高了检测敏感性。Quiel等[14]利用电蛋白质芯片技术快速鉴定金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌的致病因子，此方法比传统的SDS-PAG和Western immunoblotting检测方法更快速、更安全，灵敏度也更高。同时，Zhu等[15]开发出一种Epstein-Barr病毒（EBV）蛋白芯片鉴定EBV蛋白激酶BGLF4的底物，并证明BGLF4对EBV裂解周期的影响不仅通过EBV裂解DNA的磷酸化复制于病毒蛋白，同时受BGLF4的底物EBNA1的复制功能的干扰，使EBNA1成为潜在的治疗靶向。苏乃伦等[16]运用SELDI蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达，结果发现19个蛋白表达差异峰，方法简便，敏感性高。田淑梅等[17]利用蛋白质芯片技术检测100例幽门螺杆菌抗体，结果表明CagA阳性为55%，VacA阳性为29%，Ure阳性为16%，与ELISA与免疫印迹法相比，其检测更快速高效，灵敏度更高。

3.3 自身免疫性疾病上的应用 自身免疫性疾病（Autoimmune disease，AID）的发病原理与诊断程序相当复杂，蛋白质芯片技术已成为检测自身免疫性疾病的有力工具。如今，对自身免疫性疾病的诊断主要靠相关的临床表现以及患者血清中相应抗体的检测。临床上传统的自身抗体检测方法主要有酶联免疫吸附法、免疫斑点、免疫沉淀、免疫印迹法等[18]。然而这些方法分别存在着相应的不足之处。比如间接免疫荧光法，虽然其灵敏度高，检测范围广，但是其操作相对复杂，需要昂贵的仪器设备，很难推广到基层医院，又如酶联免疫吸附法，虽然操作相对简单，不需要特别的荧光仪器，但其假阳性产生较多。所以这些传统方法在一定程度上无法满足人们对自身免疫性疾病的检测需求[19]。庆幸的是蛋白质芯片技术的开发与使用为自身免疫性疾病的诊断与治疗提供了更优越的方法。例如Long等[20]利用蛋白质芯片检测风湿病患者，其灵敏度达到87.5%，特异性达到96.7%，且与晚期风湿病组（病程>12个月）和健康组相比，蛋白峰（m/z分别为1014与1061）在早期风湿病组（病程<12个月）有显著上升，其结果比传统的酶联免疫吸附法有更高的灵敏度。Wright等[21]利用蛋白质芯片对强直性脊柱炎患者的多种自身抗体进行检测，取得良好效果。王国强等[22]开发出一种能同步检测12种常见自身抗体的蛋白质芯片诊断系统，临床研究表明此系统对这12种抗体的检测达到80%~96.3%的敏感度以及86.7%~100%的特异性，符合率高。

4 蛋白质芯片技术的不足与展望

蛋白质芯片技术的开发在后基因组时代蛋白质组学的研究上具有巨大的应用价值，并且已经在生命科学、医学等诸多领域得到广泛的应有，且取得了大量的成果，展现出在蛋白质研究方面无可比拟的优势。然而，相对于更完善的基因芯片技术，蛋白质芯片技术相对滞后，表现在芯片的制作与应用及诊断结果的可靠性上还存在着大量需要改进的地方。首先，现在蛋白质的表达和纯化方法无法满足蛋白质芯片系统的需求。同时，制作蛋白质芯片时须已知每个蛋白的性质，且必须用可溶性性蛋白，这样就限制了蛋白芯片的应用范围。第二，目前蛋白质结合到固定载体上的特异性还不够强，因此需要寻找更优化的材料表面的修饰方法，以使蛋白质更加特异的结合在载体上。第三，现在的蛋白质芯片技术仍需增强芯片结合更多蛋白质种类与数目的能力，收集更丰富的信息。第四，蛋白质芯片制作程序复杂，蛋白质容易变性，加之昂贵的检测设备与试剂阻碍了芯片的大规模使用。因此研制出快速、简洁、低价的制备与检测方法，在降低其成本的同时，进一步提高芯片检测的灵敏度，将成为往后蛋白质芯片开发的难点与重点。在可以预见的未来，随着蛋白质芯片技术的不断完善，其自动化、微型化、高灵敏度、高通量、高特异性等优势将进一步得到体现，并在生命科学研究的各个领域发挥出越来越举足轻重的作用，也必将在各种疾病的诊断与防治中展现出巨大的应用潜力。

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