碱性成纤维生长因子在脂肪干细胞治疗心肌梗死中的作用

覃杰 闫翠 陈极锋 单鸿

干细胞治疗有望治愈心肌梗死和预防慢性心力衰竭，但伦理、干细胞来源有限及异体干细胞免疫排斥等问题尚未解决，阻碍了干细胞在临床的进一步应用[1-3]。Yeh 等[3]报道脂肪干细胞(ADSC)可向多种细胞分化，并能分泌多种细胞因子。李博等[4]报道ADSC能有效改善心肌梗死后的心功能。与骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞和脐带血干细胞等相比，ADSC具有来源广泛、容易取材、损伤较小、自体移植无免疫排斥、体外增殖速度快优势[3-4]。使用ADSC移植可克服伦理、干细胞来源有限及异体干细胞免疫排斥等问题，但单纯使用ADSC移植治疗心肌梗死，效果欠佳[2-4]。Zhang等[5]报道碱性成纤维生长因子(bFGF)可促进内皮细胞和平滑肌细胞增殖，增加新生血管，提高局部血流量。Yao等[6]报道bFGF可提高梗死区域血管密度，减少心肌梗死面积。少有文献研究报道bFGF在ADSC治疗心肌梗死的作用。为此，本研究使用ADSC及bFGF移植治疗心肌梗死，探讨bFGF在ADSC治疗心肌梗死中的作用。

材料与方法

一、ADSC的分离培养及标记

取大鼠腹股沟脂肪组织，以磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗碎片及血细胞。在37℃下用0.1 g/L I型胶原酶(Sigma)消化脂肪组织后离心、过滤、重悬，接种至培养皿培养，3 d后换液，弃除未贴壁细胞，每隔3 d换液，贴壁细胞长至90%时，使用胰酶消化传代，并用PKH26标记细胞。

二、流式细胞分析

使用 PE标记的抗大鼠 CD29(Biolegend)、FITC标记的 CD90(Biolegend)、FITC标记的CD45(Biolegend)以及PE标记的CD34(Santa Cruz)抗体进行流式细胞分析。4℃恒温避光孵育30 min后，PBS冲洗2次，离心弃上清液。用10 g/L多聚甲醛(PFA)溶液固定，设同型对照，4 h内完成流式细胞仪(FACS)检测。

三、ADSC的分化潜能鉴定

成脂诱导:1.0×105细胞/孔的密度接种于6孔培养板，待细胞密度大于90%后，加入含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、5 μg/ml胰岛素的H-DMEM成脂诱导液，于37℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱中继续培养，每3 d更换新鲜诱导液。诱导分化20 d后弃成脂诱导液，PBS洗3次，1 g/L中性甲醛室温固定1 h，PBS清洗后加入油红O染色1 h，蒸馏水冲洗，显微镜(×400)下观察细胞内脂滴的形成情况。

成骨诱导:以1.0×105细胞/孔的密度接种于6孔培养板中。当细胞长至80%融合时，将培养基更换为含100 ml/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 μg/ml维生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠的成骨诱导液，于37℃、体积分数为5%CO2恒温培养箱中继续培养，每隔3 d更换新鲜诱导液。诱导分化第14日吸去成骨诱导液，室温下用1 g/L中性甲醛固定30 min，PBS清洗后加入茜素红(pH=4)滴染3～5 min，显微镜(×400)下观察钙结节的形成情况。

四、心肌梗死模型与细胞移植

65只SD大鼠由中山大学实验动物中心提供。本研究经中山大学附属第三医院伦理委员会批准。用戊巴比妥钠麻醉大鼠后，使用容量可调的动物呼吸机辅助呼吸。打开胸廓后，剪开心包，用6-0聚丙烯缝线在距起源2～3 mm的位置结扎左冠状动脉前降支(LAD)。结扎成功时LAD供血部位(左心室前壁)立即变白，搏动减弱，心电图示ST-T段弓背抬高。心肌梗死造模1周后，死亡5只，将剩余60只大鼠随机分成4组(PBS组、bFGF组、ADSC组和ADSC+bFGF组)，每组15只。PBS组单纯注射PBS，bFGF组单纯注射bFGF，ADSC组注射含4×106ADSC悬液，ADSC+bFGF组注射含4×106ADSC的bFGF悬液。

五、LVEF检测及心脏组织学检测

心肌梗死后4周用14.0 MHz探头行大鼠心脏超声检查，测量LVEF。

心脏超声检查后处死动物，迅速取出心脏冻存于新鲜的OCT冰冻培养基中或者固定于4%多聚甲醛，用于制备冰冻或者石蜡切片。梗死面积计算:梗死区的心内圆周长/整体心内圆周长×100%。每一个标本梗死面积为5个代表性切面的梗死面积平均值。

六、免疫荧光与免疫组织化学染色

组织切片以抗cTnT(Santa Cruz)、抗平滑肌肌动蛋白SMA(美国Sigma)、抗vWAg(丹麦Dako)进行免疫染色。免疫组织化学染色采用DAB显色法。在Ⅷ因子染色的切片上测量梗死区微血管数量:先在100倍镜下识别梗死区，后在200倍下计算血管的数量。计算所有管腔中被横切的血管数。每一标本取5个代表性的切片，每一切片在光学显微镜下计数5个代表性视野，取平均值。

七、统计学处理

结 果

一、4组心肌梗死大鼠的基本情况

4组大鼠的性别比例比较差异无统计学意义(P=0.23)，体质量比较差异亦无统计学意义(P=0.17)，见表1。

表1 4组心肌梗死大鼠的基本情况

二、ADSC特征及诱导

成功分离ADSC，流式细胞分析结果显示绝大多数ADSC表达CD29和CD90，不表达 CD34和CD45。多向诱导分化结果显示ADSC可分化为脂肪和骨骼。成脂诱导分化20 d后，油红O染色结果见成簇脂肪滴形成(图1A)。成骨诱导分化14 d后，茜素红染色结果可见大量骨组织(图1B)。

图1 ADSC成脂及成骨诱导分化(×400)

三、4组心肌梗死大鼠的LVEF比较

4组 LVEF比较有差异(F=146.45，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF组及ADSC组的LVEF高于PBS组和bFGF组(P＜0.01)，ADSC+bFGF组的LVEF高于ADSC组(P＜0.01)，PBS组和bFGF组的LVEF比较差异无统计学意义(P=0.33)，见图2。

四、4组大鼠的心肌梗死面积比较

4组心肌梗死面积比较差异有统计学意义(F=114.56，P＜0.01)。其中，ADSC+bFGF组及ADSC组的心肌梗死面积小于PBS组和bFGF组(P＜0.01)，ADSC+bFGF组的心肌梗死面积小于ADSC组(P＜0.01)，PBS组和bFGF组的心肌梗死面积比较差异无统计学意义(P=0.28)(图3AE)。

图2 各组心肌梗死大鼠的LVEF比较

五、ADSC分化

ADSC移植4周后，组织切片免疫荧光染色显示在注射部位出现PKH26阳性且SMA阳性、cTnT阳性和vWAg阳性细胞。

六、各组大鼠梗死部位新生血管比较

免疫组织化学染色结果显示新生毛细血管数量由多到少依次为 ADSC+bFGF组 [(235.26±24.12)个/mm2]、ADSC组 [(176.28±20.22)个/mm2]、bFGF组 [(118.60±21.46)个/mm2]及PBS组 [(64.58±18.88)个/mm2]，见图4AD。各组大鼠新生血管密度比较差异有统计学意义(F=519.20，P＜0.01)，见图4E。

讨 论

为了更有效地治疗心肌梗死，国内外研究人员在初期的动物实验中利用骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞及脐带血干细胞等治疗心肌梗死取得了较好的成绩，并进入临床试验阶段[2-5]。本研究结果显示大鼠ADSC可成功诱导为脂肪细胞、成骨细胞，说明ADSC具有多项分化潜能，与文献报道一致[3-4]。因此，本研究采用ADSC可解决伦理、干细胞来源有限及异体干细胞免疫排斥等问题。

图3 各组大鼠的心脏大体标本及梗死面积比较

图4 各组心肌梗死大鼠新生毛细血管数量比较

虽然早期动物实验显示干细胞治疗可提高左心功能，但近期 Naumova等[7]在动物实验中发现胚胎干细胞移植后LVEF略有增加的主要原因是旁分泌作用，而不是干细胞分化为心肌细胞，因为只有少于0.5%的胚胎干细胞分化为心肌细胞。我们前期动物实验结果亦显示骨髓间充质干细胞未能明显提高LVEF，干细胞在7 d内大量死亡。REPAIRAMI及BOOST试验等大型随机对照实验显示在短期及12～18个月随访中干细胞移植均未能明显改善心功能、减少梗死面积和瘢痕组织重塑[8-9]。

干细胞治疗心肌梗死疗效低于预期的原因较多，常见的有宿主炎症反应、机械损伤、适应不良、缺血或缺血再灌注损伤、细胞凋亡等[8-10]。Yao等[6]报道bFGF可提高梗死区域血管密度，减少心肌梗死面积。在4组大鼠的基本条件一致的基础上，本研究发现ADSC+bFGF组及ADSC组的LVEF高于PBS组和bFGF组，ADSC+bFGF组的LVEF高于ADSC组，PBS组和bFGF组的LVEF比较差异无统计学意义。此结果说明bFGF能促进ADSC改善心功能，而单纯bFGF并未能改善心脏功能。此外，ADSC+bFGF组心肌梗死面积最小，提示bFGF能促进ADSC缩小梗死面积，改善心功能。

为了探讨bFGF在ADSC治疗心肌梗死中的作用及机制，我们在ADSC移植4周后取大鼠心脏做免疫组织荧光染色及Ⅷ因子免疫组织化学染色。免疫组织荧光染色显示在注射部位出现PKH26阳性且SMA阳性、cTnT阳性和vWAg阳性细胞，说明ADSC可分化成心肌细胞、小血管以及血管内皮细胞。Ⅷ因子免疫组织化学染色结果显示，毛细血管数量由多高到少依次为ADSC+bFGF组、ADSC组、bFGF组及PBS组，各组间新生血管密度比较差异有统计学意义，说明bFGF能促进ADSC分化为新生毛细血管，改善心肌梗死部位的供血，提高移植细胞存活，促进心肌梗死愈合，缩小梗死面积，提高心功能。

综上所述，bFGF能够促进ADSC分化为心肌细胞和新生毛细血管，改善心功能，有望促进干细胞治疗心肌梗死在临床的应用。

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