黄连等中药对多重耐药性鲍曼不动杆菌的筛选研究①

，②，，，，，，，，

（1.右江民族医学院病原生物学与免疫学教研室，桂西微生物感染研究重点实验室，广西 百色 533000 E－mail：38673360＠qq.com；2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；3.广西百色市人民医院，右江民族医学院附属西南医院，广西 百色 533000；4.右江民族医学院药学院，广西 百色 533000）

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，Ab）存在于正常人体的皮肤、呼吸道和泌尿道，也广泛分布于自然界的水及土壤中，抵抗力强，干燥表面可以长期存活；定植率高，75%住院患者可发生定植，在危重病症患者中感染率较高［1］。该菌是引起医院感染的常见病原菌，为条件致病菌［2］。随着抗生素的广泛使用，近年来Ab感染呈持续上升趋势，且呈泛耐药状态。美国疾病控制和预防中心（CDC）调查显示：泛耐药不动杆菌（PDR－Ab）从1994年9.4%上升到2007年的40.6%［3］。其泛耐药问题已经成为重症监护病房感染控制的难题，也是重症感染患者重要的死因之一。国内有报道［4］称Ab患者总死亡率为24.0%。因此寻找新的抗菌药物或药物增效剂势在必行。我国中草药资源丰富，不少药物具有抗菌作用［5］。本研究用黄连等中草药对Ab进行药敏实验，找出其对Ab的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1 材料和方法

1.1 菌株 65株鲍曼不动杆菌是2014年2～12月右江民族医学院附属医院和百色市人民医院临床分离的菌株，标本来源于痰液标本、创伤分泌物、深静脉导管、血标本等。所有菌株经VITEK微生物分析仪鉴定确认。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 仪器和培养基 VITEK2compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统（法国，biomerierx.inc），AST－GN09药敏卡，GN鉴定卡。水解酪蛋白（MH）琼脂粉（杭州天和微生物有限公司）。天平（EEA，DT500A），电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），生物安全柜。质控药敏纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）：庆大霉素（GEN），链霉素（STR），氯霉素（CHL），克林霉素（CLI）。

1.3 药物 黄连、五味子、夏枯草等购自陕西昂盛生物医药科技有限公司。苏铁、铁包金、木蝴蝶、马蹄金、穿心草、高良姜、三叶酸全草由我院药理学院潘勇老师提供。

1.4 方法

1.4.1 药物制备 水提液的提取：黄连100g，磨碎，加水1～2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文火煎30 min，过滤。药渣加水0.5～1L，按上述方法进行再次操作后，过滤药液，合并2次滤液，用文火浓缩为100 ml，使药液浓度为1∶1（每1ml药液含生药1g）。4℃保存备用［6－7］。用同样的方法制备夏枯草、三叶酸全草、五味子、苏铁、铁包金、木蝴蝶、马蹄金、高良姜、穿心草等水提液。醇提液：将黄连等药品干燥粉碎，用6倍75%乙醇回流提取2次，减压回收乙醇浓缩成1∶1的药液待用［8］。用同样的方法制备夏枯草、夏枯草、三叶酸全草、五味子、苏铁、铁包金、木蝴蝶、马蹄金、高良姜、穿心草的醇提液。大蒜提取液：新鲜剥皮的大蒜，取200g，首先用高锰酸钾（1∶1 000）溶液浸泡1 h，然后用无菌蒸馏水洗涤2次，放置于无菌的研钵内，捣成糊状，按1∶1加入无菌蒸馏水，离心沉淀混合液，取上层清液（浓度为1g/ml）存放以备用。

1.4.2 K－B药敏纸片法 将Ab接种于普通培养基中，37℃培养24h，用接种环挑取形态相似菌落4～5个，接种于5ml的MH肉汤中，37℃ 孵育2h，用生理盐水配制成浓度为0.5麦氏/比浊标准，约含1～2108CFU/ml的菌悬液。取高压灭菌后的空白药敏纸片，在无菌操作下，将空白药敏纸片放入样液中，浸泡1h，取上述的菌悬液用棉签涂布于MH平板，再将含有样液的纸片沥水，微干后均匀铺在含菌MH平板表面，37℃培养24h后观察记录结果。

1.4.3 琼脂稀释法测MIC 采用美国CLSI标准琼脂稀释法测定各种中药提取液的MIC［9］。抗菌药物测定浓度范围为1～0.03125g/ml。各浓度的中药提取液按1∶10比例分别加入经高压灭菌，并在45～50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度5～6mm。制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，用微量移液器吸取制备好菌液（约2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5～8mm的菌斑。接种好后置37℃培养箱中24h观察结果，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。

2 结果

2.1 菌株分离结果 耐头孢菌素和磺胺类、碳青霉烯类的Ab为22株，耐头孢类、碳青霉烯类、P－内酰胺酶抑制剂、磺胺类的Ab为20株；耐头孢菌素、P－内酰胺酶抑制剂、碳青霉烯类、喹诺酮类、磺胺类、氨基糖苷类的Ab菌株为23株。

2.2 各种中药（K－B）药敏纸片法结果 由表1、表2可以看到，黄连、木蝴蝶、马蹄金水提液和醇提液对多重耐药Ab敏感，苏铁、铁包金、穿心草对多重耐药Ab轻度敏感，夏枯草、三叶酸全草、五味子、高良姜水提液和醇提液对多重耐药Ab均耐药，大蒜对多重耐药Ab耐药。

表1 药敏纸片法测水提各种中药对不同耐药类型Ab的影响

2.3 琼脂稀释法测MIC结果 黄连、木蝴蝶、马蹄金水提液，MIC为1g/ml、0.5g/ml、0.5g/ml、1g/ml、1 g/ml、0.5g/ml，见表3。

3 讨论

黄连是临床常用大宗药材之一，是传统的抗菌抗病毒药物，抗菌谱广。现代药理研究表明［10］，黄连根茎中含有多种异喹啉类生物碱，其中小檗碱（Berberine，Ber）又名黄连素，为黄连的主要成分，含量约5%～8%，具有对热不稳定性，有极其广泛的抗菌谱，对某些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有一定的抑制作用。王育红等［11］曾对56种金黄色葡萄球菌的体外抑菌实验用中药的水煎剂，包括黄连等实验结果显示所选用的中药水煎剂对此26种金色葡萄球菌都有抑制作用。我们在此研究的基础上，进一步研究黄连对Ab的作用。本次实验发现黄连的水提液和醇提液对Ab敏感，MIC为1g/ml；对不同类型的耐药性Ab没有明显区别。马蹄金为旋花科植物马蹄金（Dichondra repens Forst）的全草，又名黄疸草。味苦、辛，性微寒，主入肺经和胃经，具有清热解毒、利水、活血的功效。马蹄金提取物对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性致病球菌的抗菌作用较强；而对大肠杆菌、伤寒杆菌、变形杆菌、产气杆菌等革兰氏阴性杆菌作用较弱，主要为抑制作用［12］。本次实验发现马提金的水提液和醇提液对Ab敏感，MIC为0.5g/ml，其对不同耐药类型的Ab没有明显区别。木蝴蝶Semen.oroxyli为柴葳科木蝴蝶属植物木蝴蝶Orocy－lumineicum（L.）Vent.（Big－nonia indica L.）的成熟种子。木蝴蝶性味苦、甘、凉，入肺、肝、胃经。有清肺、利咽、止咳、舒肝和胃之功效。主治肺热咳嗽、喉痹、音哑、肝胃气痛、疮口［13］。木蝴蝶种子含黄芩甙元（Baicalein）和白杨素（chrysin）。黄芩甙元具有抗炎、抗变态、利尿和利胆等作用［14］。本实验结果表明木蝴蝶的醇提液和水提液对Ab敏感，MIC为0.5g/ml，其对不同耐药类型的Ab没有明显区别。

表2 药敏纸片法测醇提各种中药对不同耐药类型Ab的影响

表3 琼脂稀释法测MIC结果 （单位：g/ml）

［1］陈超男.重症监护室泛耐药鲍曼不动杆菌感染暴发流行调查与控制［J］.中国消毒学杂志，2010，27（2）：202－203.

［2］倪语星，尚红.临床微生物学与检验学 ［M］.北京：人民卫生出版社，2007：159－162.

［3］Peleg AY，Seifert H，Paterson DL.Acinetobacter baumannii：emer－gence of a successful pathogen［J］.Clin Microbiol Rev，2008，21（3）：535－582.

［4］石岩，刘大为，徐英春，等.泛耐药鲍曼不动杆菌感染临床治疗初探［J］.中国感染控制杂志，2007，7（1）：34－37.

［5］蔡燕，邢艳，谢文光.中药抗菌作用研究进展［J］.中国医药导报，2011，8（6）：9－10.

［6］李彦枫，张师愚.中药提取分离新技术的研究进展［J］.中外医疗，2009，29（10）：102－103.

［7］谢田，王萍，傅雪艳，等.中药提取分离方法的新进展［J］.中医药信息，2004，21（6）：21－23.

［8］石静，徐云玲，聂晶.女贞子三萜类化学成分研究［J］.时珍国医国药，2012，23（6）：1568.

［9］National committee for clinical laboratory standards.methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically－sixth edition：approved standard M7－A6［S］.NCCLS，Villanova，PA，USA，2003.

［10］田代华.实用中药辞典：下卷［M］.北京：人民卫生出版社，2005：1715－1724.

［11］李风学，王育红.24种中药水煎剂与免煎颗粒剂对临床菌株的体外抑菌作用［J］.江苏中药，2006，27（4）：52－54.

［12］曲莉莎，曾万玲，谢达莎，等.马蹄金提取物镇痛抗炎及抑菌作用的实验研究［J］.中国中药杂志，2003，28（4）：374－377.

［13］中国药科大学.中药辞海［M］.北京：中国医药科技出版社，1996：807.

［14］Koda A，Pharmacological actions of baicalin and baicalein.1.on active anaphylaxis［J］.Nippon Yakurigaku Zasshi，1970，66（2）：194.