不同补料方式对酿酒酵母高密度发酵的影响

荣博涵，甄玉国，2*，赵小丽，刘乙辰，冀红芹

（1.吉林农业大学 吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林 长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林 长春 130114）

不同补料方式对酿酒酵母高密度发酵的影响

荣博涵1，甄玉国1，2*，赵小丽1，刘乙辰1，冀红芹1

（1.吉林农业大学 吉农博瑞奶牛饲料研发中心，吉林 长春 130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林 长春 130114）

以酿酒酵母为发酵菌种，使用自主优化筛选配制的糖蜜培养基，分别采用残糖反馈分批补料和连续流加补料方式，优化发酵工艺条件以提高发酵液中菌体密度。残糖反馈分批补料，拟设定3个梯度，分别控制对数期发酵液中残糖含量在0.5%～1.5%，1.0%～2.0%，1.5%～2.5%。三次试验结果分别为，试验1菌体培养32 h时达到最大生物量，为28.88 g/L；试验2菌体培养52 h时达到最大生物量，为27.43 g/L；试验3菌体培养24 h时达到最大生物量，为22.06 g/L。通过连续流加补料培养菌体，结果培养30 h时达到最大生物量，为29.29 g/L。

糖蜜；高密度发酵；残糖反馈分批补料；流加补料

酵母菌是一类单细胞真核微生物的统称，并非是一类系统的生物分类总称。酵母菌包含多类分支且相互之间生物特性差别较大，目前已知酵母包含1 000多种[1]。大多数酵母菌为兼性好氧型，易于培养，繁殖迅速且方便遗传或变异操作[2]。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是人类最早利用于实际生产的酵母菌属，经研究发现，酿酒酵母含有多种蛋白质、氨基酸、维生素以及矿物质。迄今为止，酿酒酵母已被广泛应用于生物工程、发酵工程、制药、医疗等多种领域。作为饲料添加剂，大量实验证明酵母作为饲料添加剂可以从不同方面提高或增强动物的生产性能，对于现阶段我国饲料行业中的抗生素滥用现象，酵母添加剂也许可以作为未来健康饲养的发展方向。

高密度发酵技术作为一种生化工程技术被广泛应用于发酵工程当中，作为衡量菌种效益的标准不断的进行改进与优化。一般认为培养密度在20～200 g/L即为高密度发酵。想要实现酵母高密度发酵也并非易事。温度、pH值、溶氧与培养基成分等外在培养条件的不同，菌种自身的发酵能力差别以及各种因素之间的互作，都会将筛选工作的难度大大提高[3-4]。

糖蜜是制糖工业的副产品，其内部成分因其制糖时的原料和加工工业的不同而有差异，但大致可分为甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜和淀粉糖蜜等。糖蜜因其价格便宜，易于获得与处理等特点，常作为生产酵母的主要原材料。不同种类的糖蜜所含的营养成分大不相同，加之近年来制糖工艺的不断精进，糖的提取率不断提高，致使糖蜜中可发酵糖含量下降，导致酵母生产质量难以调控[5]。本研究针对酿酒酵母，以实验室优化筛选的糖蜜培养基为基础，发酵基本条件参照实验室摇瓶试验为准，采取不同的补料方式，探索该菌种在糖蜜为碳源的条件下的最大生物量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：由长春博瑞饲料产品研发中心保存与提供。

1.1.2 培养基

种子培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextros，YPD）培养基：2 g酵母浸粉，2 g蛋白胨，4 g葡萄糖溶于200 mL蒸馏水中。

有氧发酵培养基采用糖蜜培养基：可溶性糖含量5%，0.5%尿素，0.05%甘氨酸，0.05%硫酸铵。

补料培养基采用糖蜜培养基：可溶性糖含量20%，2%尿素，0.2%甘氨酸，0.2%硫酸铵。

1.2 仪器与设备

AL104电子天平：瑞士METTLER TOLEDO集团；UV-1201分光光度计：日本岛津公司；5810R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；BLBIO-10SJ-50SJ 10 L发酵罐：上海百仑生物科技有限公司；SPX-150型生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 摇瓶种子培养

无菌条件下接种一环保藏菌种至YPD斜面培养基，30℃复苏活化种子24 h，活化后再接种一环至种子培养基，30℃、180 r/min扩大培养24 h，而后以5%接种量接种进入50 mL有氧培养基，30℃、180 r/min培养24 h。最后以5%的接种量接种进入5 L发酵罐中进行高密度培养。

1.3.2 残糖反馈分批补料对酿酒酵母发酵的影响

试验1：控制菌体进入对数期（发酵开始8 h）发酵液中残糖含量在1.0%～2.0%；试验2：控制菌体进入对数期（发酵开始8 h）发酵液中残糖含量在0.5%～1.5%；试验3：控制菌体进入对数期（发酵开始8 h）发酵液中残糖含量在1.5%～2.5%。其他发酵基本参数全程保持一致（温度（30±0.5）℃；pH值为5.00±0.15；罐压0.04 kPa，溶氧30%；接种量5%）。发酵过程中，每2 h取样，稀释100倍后，测定波长560 nm处的吸光度值。

1.3.3 连续流加补料对酿酒酵母发酵的影响

控制菌体进入对数期（发酵开始8 h）后发酵液中残糖含量在0.5%～1.5%范围内，流加速率为20 g/（100 mL·h）。其他发酵基本参数同上。发酵过程中，每2 h取样，稀释100倍后，测定560 nm波长处的吸光度值。

1.3.4 补糖策略

发酵开始后8 h进行补糖，补糖分为残糖反馈补料以及连续补料两种方式，使发酵液中残糖含量维持在0.5%～2.0%范围内。

1.3.5 指标测定方法

残糖含量测定采用蒽酮比色法；光密度测定：于560 nm波长处测定适当稀释的发酵液光密度值OD560nm；细胞干质量测定：离心所得菌体85℃恒温烘干至质量恒定。

2 结果与分析

2.1 初始补料时间的确定

采用糖蜜培养基，在5 L的发酵罐中进行发酵实验，定时取样测定发酵液的OD560nm值，以时间（h）为横轴，560 nm波长处OD560nm值为纵轴，绘制酿酒酵母的生长曲线，结果见图1。从图1可以看出，0～4 h为酵母生长潜伏期，4～12 h为对数生长前期，12～18 h为对数生长后期，18～22 h为平台期，22 h后为衰亡期，菌体OD560nm开始下降，这与前期摇瓶实验的菌体生长规律基本吻合。

图2为对比补料对菌体生长的影响，其中OD1为正常的菌体培养的生长曲线，培养过程中不进行任何补料措施；OD2则为补料试验，即从发酵2 h开始补料，每隔2 h补料一次，可溶性糖质量浓度为200 g/L。由图2对比两次实验发现，0～8 h之前，补糖并不能加速菌体生长，而8 h以后，补糖可以提高菌体生长且效果显著，这也与前期摇瓶实验的结果相吻合，所以拟定于发酵8 h时开始补料。

实验结果表明，当菌体处于迟缓期以及对数生长初期，即使进行补料，菌体也不会大量增殖。这可能是由于菌体处于潜伏期时生长缓慢且对碳源的需求与消耗很小，但进入对数生长期后，随着菌体大量繁殖，发酵液中的可溶性糖量也急剧下降。因此，为了保证菌体在对数期大量繁殖时可以有足够的营养物质供给，所以，应在菌体进入对数生长期时（发酵8 h）进行补料。

2.2 优化分批补料方案

采用糖蜜培养基，在30℃，pH 5.0±0.3（摇瓶实验筛选），溶氧控制在30%～50%条件下，采取残糖反馈补料策略，定时取样，测定发酵液的OD值和残糖含量。不同控糖浓度对酿酒酵母生长的影响结果见图3，图3中OD3、OD4与OD5分别为试验1、试验2和试验3的菌体生长曲线。

由图3可知，试验1结果表明，当将菌体对数生长期时发酵液中的可溶性糖浓度控制在1.0%～2.0%范围内，菌体对数期生长缓慢，菌体数量增幅较小，达到最大生物量的耗时较长，菌株于52 h时达到最大生物量27.43 g/L。试验2结果表明，将菌体对数生长期时发酵液中的可溶性糖浓度控制在0.5%～1.5%范围内，可以有效的在菌体生长对数期提高菌体生长速率，缩短发酵时间，并且提高最终的菌体浓度，菌株于32 h时达到最大生物量28.88 g/L。试验3结果表明，维持发酵液中较高浓度（1.5%～2.5%）的可溶性糖可以使菌体提前进入对数生长阶段，并且在一定时间内（4～12 h）表现出很好的生长速率，但是衰退现象也极为明显，菌株于发酵20 h时提前进入平台期，到达最大生物量22.06 g/L。

适宜的糖浓度有利用菌体生长时快速利用。当菌体由迟缓期转入对数期时，菌体开始大量繁殖，同时消耗大量培养基中的碳源（主要为可溶性糖），此时通过补料的方式维持发酵液中的营养成分可以延长菌体对数期的生长时间，从而提高单位体积内的菌体数量。但是，如果过量的补料（碳源），导致发酵液中的含糖量过高，就会使酵母菌株产生Crabtree效应，即葡萄糖阻遏作用，即使是在通氧的条件下，酵母菌仍然会进入发酵增殖，从而产生大量酒精，进而抑制酵母生长[2]。

由图3可知，与其他两组相比，试验2将发酵液中的残糖控制在0.5%～1.5%的区间内可以很好延长菌体对数期的生长时间以及提高最终的菌体产量，缩短达到菌体最大量的时间。试验2最终菌体获得量分别高于其他两组5.29%与3.92%，达到最大生物量的时间也较试验1缩短了16 h。因此，高密度培养阶段，发酵液中残糖浓度应保持在0.5%～1.5%范围内。

2.3 对比两种补料方式对酵母生长的影响

以前期高密度培养实验为基础，在相同的培养条件以及各项参数下，使用连续流加补料方式取代残糖反馈补料策略，补料流加速率为20 g/（100 mL·h），定时取样，测定OD560nm值，两种补料方式对酵母生长的影响结果见图4，其中OD4为以残糖反馈补料方式高密度培养酵母的生长曲线，残糖浓度控制在0.5%～1.5%范围内，而OD6为以连续流加补料方式控制残糖浓度在0.5%～1.5%范围内的酵母生长曲线。

由图4可知，采用流加补料方式，酵母菌体于34 h达到最大值，最大生物量为29.29 g/L。相较于于反馈补料方式，流加补料方式可以更好的促进酵母增值，避免出现对数生长期内出现菌体激增后生长迟缓的现象。流加补料方式最后获得的菌体生物量也略高于分批补料方式，约提高1.41%。

结果表明，采用流加补料方式，酵母生长良好。增殖速度稳定，且在培养相同时间点上略高于流加方式。从最后的培养结果来看，不论是在最终的菌体数量还是在到达最大生物量的培养时间，采用流加方式都优于分批补料的方式。这可能是由于采取分批补料方式时，单次投入大量补料培养基，迅速提高发酵液中的碳源含量，导致菌体因为环境改变而打乱生长规律，也因过高的糖浓度是酵母细胞产生酒精，从而短暂抑制生长。而连续流加培养则避免了分批补料方式的这一短处，不会造成因环境改变产生的菌体应激，从而是菌体增殖更为规律，良好[6]。

3 结论

使用糖蜜培养基高密度培养酿酒酵母时，应控制对数期发酵液维持较低的可溶性糖含量，试验结果表明，控制对数期发酵液中残糖含量在0.5%～1.5%时，菌体培养32 h时达到最大生物量，为28.88 g/L；在1.0%～2.0%时，菌体培养52 h时达到最大生物量，为27.43 g/L；在1.5%～2.5%时，菌体培养24 h时达到最大生物量，为22.06 g/L。因此，将对数期残糖控制在0.5%～1.5%为最宜范围，在此范围内培养时间最短，所获菌体量最大。

通过连续流加补料代替残糖反馈补料高密度培养菌体，残糖浓度均控制0.5%～1.5%范围内时，结果培养34 h时达到最大生物量，为29.29 g/L。因此，连续流加方式更适宜用于在相同条件下高密度培养酿酒酵母。

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Effect of fed-batch fermentation modes on high density fermentation ofSaccharomyces cerevisiae

RONG Bohan1,ZHEN Yuguo1,2*,ZHAO Xiaoli1,LIU Yichen1,JIHongqin1

(1.JAU-BoruiDairy Science and Technology R&D Center,Jilin AgriculturalUniversity,Changchun 130118,China; 2.Technology Center of Changchun Borui Feed Group Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Using Saccharomyces cerevisiae as fermentation starter,the fermentation process for improving S.cerevisiae density in the laboratory screened single molasses medium was optimized by residual glucose feedback fed-batch and continuous flow plus feeding mode.The fed-batch of glucose feedback testwassetthree gradientsto controlthe contentofresidualglucose(soluble glucose)in the fermentation broth of0.5%-1.5%,1.0%-2.0%,2.0%-2.5%,respectively.The results showed that yeast cells in test 1 fermentation broth(0.5%-1.5%)reached the maximum biomass concentration(MBC)with dry cell weight(DCW)of 28.88 g/L at 32 h;yeastcells in test 2(1.0%-2.0%)fermentation broth reached the MBC with DCWof 27.43 g/L in 52 h;and yeastcells in test3(1.5%-2.5%)fermentation broth reached the MBC with DCWof 22.06 g/L in 24 h.The feeding testresults with continuous flow showed thatyeastcells in the fermentation broth reached the MBC(DCW=29.29 g/L)in 30 h.

molasses;high-density fermentation;fed-batch of glucose feedback;fed-batch cultivation

Q93-33

A

0254-5071（2015）02-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.017

2014-12-21

吉林省重大科技攻关项目（2012ZDGG006）

荣博涵（1990-），男，硕士研究生，研究方向为动物营养与饲料。

*通讯作者：甄玉国（1970-），男，副教授，博士，研究方向为动物营养。