谷朊粉酶解物的制备及其ACE抑制肽的分离鉴定

王章存，王 颖，曹 芹，王许东，安广杰，赵学伟

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；2.郑州新威营养技术有限公司，河南 郑州 450000）

谷朊粉酶解物的制备及其ACE抑制肽的分离鉴定

王章存1，王 颖1，曹 芹1，王许东2，安广杰1，赵学伟1

（1.郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450000；2.郑州新威营养技术有限公司，河南 郑州 450000）

以谷朊粉为原料，以血管紧张素转换酶（ACE）抑制率为指标，比较4种蛋白酶的酶解效果。采用超滤、葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱（RP-HPLC）的方法分离纯化ACE抑制肽并用电喷雾飞行时间质谱联用(ESI-TOF-MS)鉴定其结构。结果表明：碱性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物具有较高的ACE抑制活性；超滤后，分子质量Mr＜1 ku的组分具有较高的ACE抑制率；分离纯化后得到小肽的ACE抑制率高达（81.03±1.20）%；由ESI-TOF-MS质谱图得出该小肽的m/z为630.89，氨基酸序列为Trp-Phe-Gln-Pro（WFQP）。

谷朊粉；酶解；血管紧张素转换酶抑制肽；分离；结构鉴定

近年来，高血压患病率持续增长，对人类健康带来巨大威胁[1]。引起高血压的原因很多，其中体内血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的调节作用被认为是最主要的原因之一。ACE对调节血压的作用变现为：一方面通过促进不具有催化活性血管紧张素Ⅰ转化为具有促进血管收缩作用的血管紧张素II；另一方面通过降解具有舒张血管紧张作用舒缓肌肽使其失活[2]。

自1965年由FERREIRA S H等[3]首次从南美洲蝮蛇（Bothrops jararaca）的毒液中发现ACE抑制肽以来，降血压肽的研究引起了人们极大的兴趣。近年来，通过酶解天然蛋白制备具有ACE抑制活性的短肽引起了广泛关注，这些肽不仅在生物体内表现出较强的降血压活性，而且具有使用安全、无副作用、易消化吸收、降压效果温和专一等诸多优点，应用前景广阔。大量的食源性ACE抑制肽已被分离出来，如鱼类蛋白[4]、陆生动物蛋白[5]、植物蛋白[6]等。我国具有丰富的小麦资源，谷朊粉是小麦淀粉生产的副产物，其蛋白质含量高达75%以上，是物美价廉的食源性蛋白源[7]。本研究以谷朊粉为原料，在比较几种不同蛋白酶水解产物的ACE抑制活性的基础上，确定以碱性蛋白酶水解谷朊粉，将酶解物经分离、纯化得到谷朊粉ACE抑制肽并对其中ACE抑制率最高的组分进行了结构鉴定和分析。旨在实现谷朊粉的应用，为进一步研究ACE抑制肽的构效关系提供了新素材。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

谷朊粉：河南省莲花味精有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合酶：丹麦Novozymes公司；血管紧张素转换酶（ACE，0.1 UN/mL）、马尿酰-组胺酰-亮氨酸（hippuryl-His-leu，HHL）：美国Sigma公司；Sephadex G-15：美国Pharmacia公司；其他化学品及试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH-601恒温水浴锅：江苏金坛市科析仪器有限公司；UV8100B紫外可见分光光度计：北京LabTech仪器有限公司；AgilentZorbax 300SB-C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5μm）、Agilent Proshell300SB-C18色谱柱（2.1 mm×75 mm，5μm）：美国安捷伦科技公司；OAPMP220超滤装置：美国Pall公司；反相高效液相色谱仪：美国Waters公司；TSQ Quantum液质联用仪（LC-MS）：美国热电科技公司。

1.3 方法

1.3.1 谷朊粉酶解物的制备

将谷朊粉以30 mg/mL的质量浓度溶解在蒸馏水中，分别用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解4 h。以0.5 h、1.0 h、2.0 h、3.0 h和4.0 h的间隔取出酶解物，沸水浴中加热5 min灭酶。然后将试样以3 000 r/min离心15 min，上清液冻干后待用。

1.3.2 ACE抑制率的体外测定

ACE抑制活性参考反相高效液相色谱（reversed-phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）法测定[8-9]。取冻干后的谷朊粉酶解物（2.5 mg/mL）溶解于硼酸盐缓冲溶液中（pH 8.3，0.1 mol/L，其中含0.3 mol/L NaCl），取10μL样品溶液加入10μLACE（溶于上述相同缓冲液）于37℃预热10 min，加入50μL 5 mmol/L的HHL（溶于相同缓冲溶液），37℃反应30 min后加入100μL 1 mol/L HCl溶液终止反应；冷却至室温后，取10μL反应产物进样，通过RP-HPLC洗脱图谱定量马尿酸的生成量，同时做样品空白和对照。

式中：c为样品不参与反应色谱峰面积；b为ACE不参加反应空白峰面积；a为ACE和样品都参与反应色谱峰面积。

色谱条件：色谱柱Zorbax SB-C18柱（4.6 mm×250 mm）；紫外检测器波长228 nm；流动相A 50%乙腈，流动相B 50%超纯水（含0.1%三氟乙酸）；流速1.0 mL/min，进样量20μL，柱温25℃，检测时间20 min。

1.3.3 ACE抑制肽的分离纯化

（1）采用PALL MinimateTM切向流超滤系统，将ACE抑制率较高的谷朊粉酶解物通过截留分子量（molecular weightcut-off，MWCO）为1 ku、2 ku和3 ku的超滤膜（Omega膜，有效过滤面积50 cm2）。超滤后的水解物各组分冻干，做ACE抑制率的体外测定。

（2）将超滤后ACE抑制率高的组分以10 mg/mL的质量浓度再次溶解在蒸馏水中。用Sephadex G-15凝胶过滤色谱柱（10 mm×600 mm）进一步分离。洗脱液为蒸馏水，洗脱流量0.5 mL/min，检测收集液波长280 nm处的吸光度值。将所需的峰收集并冻干，用于ACE抑制率的体外测定。

（3）将凝胶过滤后显示最高ACE抑制率的组分用Angilent Zorbax 300SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）进一步纯化。柱子用含有0.1%甲酸（formic acid，FA）的乙腈（5%～50%）线性梯度洗脱，流速为1.0 mL/min。在波长220 nm处检测洗脱峰并收集，冻干备用。

1.3.4 电喷雾-飞行时间-质谱

将纯化后ACE抑制率高的组分溶解在H2O∶乙腈（85∶15）中，通过装载有反相色谱柱（Agilent Proshell 300SB-C18，5μm，2.1 mm×75 mm）的LC-MS液质联用仪完成肽的鉴定及分析。流速为0.2 mL/min，柱温为30℃，流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：100%乙腈。洗脱条件：5%～30% B（0～20 min）和30%B（20～25 min）。

1.3.5 统计学分析

所有实验均重复3次，用SPSS13.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 谷朊粉酶解物的制备

谷朊粉分别用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶在最适条件下酶解。用ACE抑制率的体外测定方法评价酶解物的ACE抑制能力。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解物的ACE抑制率在3 h内随酶解时间的增加而增加，到3 h时抑制率趋于平衡。不同种类的酶酶解效果相差较大，其中碱性蛋白酶酶解物的ACE抑制率最高，其次是复合蛋白酶酶解物，木瓜蛋白酶酶解物的ACE抑制率最低。酶解3 h的碱性蛋白酶酶解物具有最高的ACE抑制率，高达（63.47±1.23）%。因此，选取碱性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物作进一步研究。

2.2 ACE抑制肽的分离纯化

2.2.1 超滤

选择3 h的碱性蛋白酶酶解物用截留分子量（MWCO）为1 ku、2 ku和3 ku的超滤膜进行初步分离。所得组分分别命名为组分Ⅰ（Mr＜1 ku）、组分Ⅱ（1～2 ku）、组分Ⅲ（2～3 ku）和组分Ⅳ（Mr＞3 ku）。测定这些组分的ACE抑制率，结果如图1所示。可见各组分的ACE抑制活性随着分子量的减小而增加，组分I（Mr＜1 ku）具有较高的ACE抑制率（72.27±1.01%），组分Ⅳ（Mr＞3 ku）的ACE抑制率最低。SEGURA MR等[10]用豇豆分离蛋白酶解得到ACE抑制肽的作用效果类似。

2.2.2 葡聚糖凝胶色谱分离

将组分Ⅰ（Mr＜1 ku）用Sephadex G-15凝胶色谱柱进一步分离，得到1、2、3三个组分，结果见图2，三个组分的ACE抑制率如图3所示。由图3可知，各组分与分离纯化之前相比，ACE抑制率有一定幅度的提高，ACE抑制率最高为（75.25±1.34）%。其中组分2有较高的ACE抑制率，组分1的ACE抑制率最差。

2.2.3 RP-HPLC

将有较高ACE抑制率的组分2经RP-HPLC纯化，得到4个组分（Fa、Fb、Fc、Fd），结果如图4所示。将各个峰收集并测定其ACE抑制率，结果见图5。由图5可知，4个组分的ACE抑制率存在差异，其中Fb的ACE抑制率最低，Fd的ACE抑制率最高可达（81.03±1.20）%。

2.3 ACE抑制肽的鉴定

组分Fd经电喷雾-飞行时间-质谱（electrospray ionization time of flightmass spectrometry，ESI-TOF-MS）得到质谱图如图6所示，其氨基酸序列为色氨酸苯丙氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸（Trp-Phe-Gln-Pro）（WFQP），m/z为630.89。目前报道的大部分ACE抑制肽都是2～15肽[11]，且大部分含有疏水性氨基酸，其分子质量在200～1 500 u[12]。本实验分离鉴定的ACE抑制肽的氨基酸组成也具有类似的特征。

ACE抑制肽的结构与活性之间的关系也是人们关注的重要内容，研究表明ACE抑制肽的活性主要取决于C-端氨基酸，C-端氨基酸为芳香族氨基酸和脯氨酸时，其抑制活性较高[13]。NAKAMURA Y等[14]以酸奶为原料制备ACE抑制肽异亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（lle-Pro-Pro）；LU J等[15]从纯顶螺旋藻酶解物中纯化出ACE抑制肽缬氨酸-谷氨酸-脯氨酸（Val-Glu-Pro）；本研究分离鉴定的四肽C-末端也是脯氨酸Pro。可见Pro对ACE抑制肽的活性具有重要意义。谷朊粉中具有较高的脯氨酸含量[16]，因此，以谷朊粉为原料制备食源性ACE抑制肽具有显著的资源优势。

3 结论

本研究比较4种酶在最适条件下的酶解物的ACE抑制率，选取抑制率较高的碱性蛋白酶酶解物进行逐级分离（超滤、凝胶层析、RP-HPLC）得到ACE抑制肽，采用LC-MS的方法对该小肽进行鉴定。

结果表明，不同蛋白酶水解谷朊粉所得ACE抑制活性具有明显差异，碱性蛋白酶的水解物活性较高。通过分离纯化和质谱分析，鉴定出一个有较高活性的ACE抑制肽，其氨基酸序列为色氨酸-苯丙氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸（Trp-Phe-Gln-Pro）。其氨基酸组成特征与文献中报道其它来源的ACE抑制肽有相似之处[13-15]。这对研究ACE抑制肽的结构和功能关系具有重要意义，同时为谷朊粉的资源利用提供新途径。

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Isolation and identification of ACE inhibitory peptide from wheat gluten hydrolysate

WANG Zhangcun1,WANGYing1,CAO Qin1,WANGXudong2,ANGuangjie1,ZHAO Xuewei1

(1.School of Food&Bioengineering,Zhengzhou University of LightIndustry,Zhengzhou 450000,China; 2.Zhengzhou NewwillNutrition Technology Co.,Ltd.,Zhengzhou 450000,China)

Using wheatgluten as raw materials and angiotensin-converting enzyme(ACE)inhibition rate as index,the effectof hydrolysis with four enzymes was compared.A novel ACE inhibitory peptide was purified by ultrafiltration,gelchromatography,RP-HPLC and then indentified by ESI-TOF-MS.The results showed that 3 h alkaline protease hydrolysates had higher ACE inhibitory activity;molecular weight of Mr less than 1 ku had higher ACE inhibition rate afterultrafiltration;the ACE inhibition rate ofpurified peptide from wheatgluten reached(81.03±1.31)%,the m/z was detected as 630.89 by ESI-TOF-MS,and the sequence and ofpurified peptide was Trp-Phe-Gln-Pro(WFQP).

wheatgluten;enzymatic hydrolysis;angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides;isolation;structuralidentification

TS209

A

0254-5071（2015）02-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.014

2014-12-06

国家自然科学基金（31071517）

王章存（1963-），男，教授，博士，主要从事食品科学和农副产品加工研究工作。