基于离子色谱技术快速定量乳制品中亚硝酸盐的含量

颜 琪，顾春华，李京宁

（1.甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030；2.宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏 银川 750000）

基于离子色谱技术快速定量乳制品中亚硝酸盐的含量

颜 琪1，顾春华2，李京宁1

（1.甘肃省食品检验研究院，甘肃 兰州 730030；2.宁夏回族自治区食品检测中心，宁夏 银川 750000）

本研究旨在建立离子色谱法快速测定乳制品中亚硝酸盐含量的分析方法。样品采用0.005 mmol/L NaOH提取，1∶1的乙腈-3%乙酸溶液作为蛋白沉淀剂，以1.8 mmol/L NaHCO3-和1.2 mmol/L Na2CO3为淋洗液，流速为1.2 mL/min，分析柱为InoPacAS14，电导检测器检测。结果表明，亚硝酸盐的检出限为0.04 mg/kg，加标回收率为96.8%～99.4%，与国标GB/T 5009.33—2010中检测方法比较，相对偏差＜1%。方法简便，快速，用于乳制品中亚硝酸盐含量的测定结果满意。

离子色谱法；亚硝酸盐；乳制品；定量检测

乳制品中含有蛋白质、脂肪、乳糖、多种维生素和矿物质等营养要素[1]。亚硝酸盐在细菌的作用下可变成具有强致癌作用的亚硝酸胺，亚硝酸盐含量过高会引起高铁蛋白症[2-3]。目前各类品种繁多的乳制品不断涌入市，随着人们生活水平的提高，越来越多的家庭把乳制品当作每日不可缺少的必需品[4]。因此，牛奶质量的好坏直接影响到人们的身体健康。随着人们对食品安全认识的提高，乳制品中亚硝酸盐的含量日渐成为人们关注的对象，乳制品中亚硝酸盐含量高低是衡量乳制品质量的重要指标之一[5-6]。因此监测乳制品中亚硝酸盐含量有着极为重要的意义。

目前，乳制品中亚硝酸盐主要依据国标GB/T 5009.33—2010《食品中的亚硝酸盐与硝酸盐》，采用比色法进行定量[7]。但实践证明，此法存在操作冗长费时，需用多种化学试剂，干扰大，灵敏度、准确度、重复性较差等缺点[8]。离子色谱法是重要的现代无机阴离子分析新技术，具有快速、灵敏、选择性好、前处理简单等优点[9]。本研究采用离子色谱法测定乳制品中亚硝酸盐的含量，通过研究其分离提取的最佳条件及色谱分析参数，旨在建立一种准确、快速测定乳制品中亚硝酸盐含量的方法，适用于大批量检测工作，进一步为亚硝酸盐的测定研究提供一定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

抽取3种市售乳制品（牛奶、酸奶、奶粉，各20个样品）；超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；乙腈、乙酸、碳酸钠、碳酸氢钠均为色谱纯：天津市康科德科技有限公司；亚硝酸钠标准储备液（100 mg/L）：北京易莱希诺公司。

1.2 仪器与设备

ICS-2000型离子色谱仪及分析系统（内置式的数字化的电导检测器SRS自动再生微膜抑制器）、Chromeleon色谱工作站：美国戴安公司；InoPacAS14分离柱：戴安中国有限公司；美国MILLIPORE（密理博）纯水机：广州哲天科学仪器有限公司；ME梅特勒分析天平：武汉宏锦科技有限公司；H-1850R高速离心机：湘仪离心机仪器有限公司；B220恒温水浴锅：上海亚荣生化仪器厂；0.45μm微孔滤膜：天津富集科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备及分析

称取经混匀的液体乳5.00 g或乳粉1.00 g（精确至0.01 g）于25 mL具塞比色管中，加入10 mL提取剂，水浴加热，取出后冷却至室温。加入10 mL蛋白沉淀剂，用去离子水定容至刻度，摇匀，静置10 min。在常温下离心，取上清液，以0.45μm滤膜过滤，备用。以保留时间定性，峰面积外标法定量，在相同色谱条件下，分别将标准溶液及样品溶液经离子色谱分析。

1.3.2 亚硝酸盐分析离子色谱条件

色谱柱：阴离子分离柱Dionex AS14柱（4 mm×250 mm）及保护柱IonPac AS14（4 mm×50 mm）；流动相：淋洗液；检测器：电导检测器；抑制器：阴离子抑制器；进样量：25μL。

1.3.3 计算公式

试样中亚硝酸盐（以NO2-计）含量按下公式计算：

式中：X为试样中亚硝酸盐的含量，mg/kg；C为试样中实测亚硝酸盐的质量浓度，mg/L；V为试样溶液体积，mL；f为稀释倍数；m为试样质量，g。

式中：X为试样中实测亚硝酸盐的含量，mg/kg；A为试样所含亚硝酸盐的含量，mg/kg；B为加入标品量，mg/kg。

1.3.4 亚硝酸盐分离提取及色谱分析条件的优化

（1）分离提取条件的优化

提取剂的种类、提取温度及时间对亚硝酸盐的提取效果有很大影响，为确保准确的定量结果，本研究对亚硝酸盐的分离提取主要从以下几个方面展开：提取剂种类的选择、提取温度及时间的优化，从而获得最优的分离提取工艺。以亚硝酸盐的回收率为评价指标，根据查阅资料，选用的提取剂为超纯水及0.005 mmol/L NaOH[10]，并且采用均匀试验设计U9（96），以提取温度、时间作为分离提取关键参数优化工艺，因素与水平见表1。

（2）蛋白沉淀剂的选择

乳制品中含有大量的蛋白质，会污染分离柱，缩短分离柱的使用寿命，使柱效降低，因此在前处理过程中必须除去蛋白[11]。GB/T 5009.33—2010《食品中的亚硝酸盐与硝酸盐》比色法中通常使用乙酸锌和亚铁氰化钾沉淀蛋白，然而此法在沉淀蛋白的同时却在溶液中引入了锌、铁等金属离子，其进入色谱柱中会发生残留，不但干扰分离效果，且会损坏色谱柱[12]。本试验查阅资料拟选用的蛋白沉淀剂种类[13]见表2。

（3）分离参数的优化

以亚硝酸盐的回收率为评价指标，选出最佳的离心转速与时间，离心试验设计因素与水平见表3。

（4）离子色谱分析参数的优化

乳制品的基体组成复杂，会存在杂质与亚硝酸盐的保留时间接近的问题，干扰目标物的测定[14]。而物质的保留时间受淋洗液的种类、浓度及流速的影响，是影响分析效果的主效因素，因此应该在保证检测灵敏度的前提下，通过优化流速、淋洗液种类及浓度，从而调整样品保留时间，避免分离过程中杂质的干扰[15-16]。

经查阅资料，筛选出选择1.8 mmol/LNaHCO3+1.2mmol/L Na2CO3作为淋洗液，且流速为1.2 mL/min[17-18]。

1.3.5 数据分析

采用Excel2010处理数据，使用IBM SPSS Statistics 19进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 提取剂对亚硝酸盐回收率的影响

提取剂对亚硝酸盐回收率的影响见图1。由图1可知，用0.005 mmol/L的NaOH溶液和超纯水分别对亚硝酸盐进行提取时，前者的效果更好，对亚硝酸盐的回收率高，这是因为亚硝酸盐（NO2-）在弱碱性条件下更能稳定地存在[19]，因此，本试验选择0.005 mmol/L的NaOH溶液作为提取剂。

2.2 提取时间及温度对亚硝酸盐回收率的影响

对亚硝酸盐分离提取工艺关键参数，即提取时间及温度的优化结果见表4。

由表4可知，第6组试验的回收率指标值99.3%最大。通过IBMSPSS Statistics 19软件对试验结果进行回归分析，得出显著性检验中R2=0.998，F＞F0.01，说明回归方程高度显著。根据回归方程各个系数绝对值的大小可判断两个因素对亚硝酸盐回收率的影响顺序为温度＞时间。通过Excel规划求解，得出最优搭配及最佳试验指标。亚硝酸盐分离提取最佳参数为提取时间30 min，提取温度60℃。按以上获得的最优分离工艺参数提取亚硝酸盐，3次回收率平均值为99.4%。

2.3 蛋白沉淀剂对亚硝酸盐回收率的影响

蛋白沉淀剂对亚硝酸盐回收率的影响见图2。由图2可知，使用乙腈-3%乙酸混合溶液提取亚硝酸盐时，沉淀蛋白效果最为理想。这可能是由于两种有机溶剂的组合能更好地沉淀性质不同的蛋白杂质[20]。比较乙腈与3%乙酸在不同体积比条件下对蛋白的沉淀效果及对亚硝酸盐（NO2-）回收率的影响，结果见表5。

从表5中可以看出，随着乙腈在混合溶液中比例的增加，沉淀蛋白的效果越来越好，且对亚硝酸盐的回收率也逐渐升高，当乙腈与3%乙酸体积比为5∶5时，沉淀蛋白的效果满意且能兼顾良好的回收率。随着乙腈体积的继续增加，沉淀蛋白的效果及对亚硝酸盐的回收率均趋于下降趋势。因此，本试验选择1∶1的乙腈-3%乙酸溶液体积比作为蛋白沉淀剂，沉淀效果较好，省去过小柱步骤，节约成本，快速有效。

2.4 离心转速和离心时间对亚硝酸盐回收率的影响

根据拟定的离心转速和离心时间进行试验，所得结果见表6。

由表6可知，在离心转速为4 000 r/min时，延长离心时间，亚硝酸盐的回收率越高，离心效果越好；在离心转速为6 000 r/min、8 000 r/min、10 000 r/min时离心效果整体均高于4 000 r/min离心时的效果，这说明，离心转速越高，杂质沉降的效果相对越好。当离心转速为8 000 r/min，离心时间为20 min时，亚硝酸盐回收率最高，达99.2%，并且上清液澄清，与杂质得到了很好的分离，便于进行下一步滤膜过滤。

2.5 离子色谱条件的选择

选择1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作为淋洗液，且流速为1.2 mL/min时，以电导率为纵坐标，洗脱时间为横坐标，得到的亚硝酸盐标准品图谱，结果见图3。由图3可知，亚硝酸盐出峰时间为4.667 min。样品以相同色谱条件进样，亚硝酸盐与乳制品中的杂质得到了很好的分离，峰形完整，达到了最佳的分离状态，乳制品中亚硝酸盐的出峰时间为4.643 min，结果见图4。

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系和检出限

将亚硝酸盐标准储备液配制成系列标准备工作溶液，测得亚硝酸盐在不同质量浓度对应的峰面积。峰面积A与质量浓度C的线性方程为C=0.593 8+0.0137 6A，相关系数R为0.999 8。以信号噪声的3倍计算检出限，亚硝酸盐的检出限为0.04 mg/kg。GB/T 5009.33—2010《食品中的亚硝酸盐与硝酸盐》中检测方法的检出限为0.2 mg/kg，检出限本法低于国标5倍。

2.6.2 回收率试验

依次对已知含有一定亚硝酸盐含量的4种乳制品进行加标回收率试验，计算其平均回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表7。

表7可以看出，亚硝酸盐的回收率在96.8%～99.4%之间，本方法测定亚硝酸盐的相对标准偏差为3.2%～5.5%。由此表明，本试验方法具有良好的准确度，可以达到定量分析的要求。

2.7 方法对比试验

随机选择乳样45个，分别按GB/T 5009.33—2010《食品中的亚硝酸盐与硝酸盐》中的比色法和离子色谱法检测样品，进行对比试验，亚硝酸盐含量测定结果取平均值，结果见表8。

表8结果表明，两种方法所测的亚硝酸盐结果基本一致，差异无统计学意义（t=0.12，P＞0.05），相对标准偏差＜1%。因此，离子色谱法具备替代比色法检测乳制品中亚硝酸盐含量的可能性。

3 结论

通过单因素试验、均匀试验设计等统计方法获得亚硝酸盐分离提取及色谱分析的最佳工艺参数：提取剂为0.005 mmol/L的NaOH溶液，提取时间为30 min，提取温度为60℃，蛋白沉淀剂为体积比1∶1的乙腈-3%乙酸溶液，离心转速为8 000 r/min，离心时间为20 min，分离液经0.45μm滤膜过滤后，以1.8 mmol/L NaHCO3+1.2 mmol/L Na2CO3作为淋洗液，流速为1.2 mL/min进行色谱分析，亚硝酸盐的回收率达99.4%。

离子色谱法亚硝酸盐的检出限为0.04 mg/kg，加标回收率为96.8%～99.4%，相对标准偏差为3.2%～5.5%，对乳制品中亚硝酸盐检测结果的重复性优于国标方法。该方法前处理简便，灵敏度、准确性高，检测限低，能够满足液态乳和乳粉中的亚硝酸盐的检测要求。

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Nitrite determination of in dairy products by ion chromatography technique

YANQi1,GU Chunhua2,LIJingning1

(1.Gansu Instiute of Food Inspection and Research,Lanzhou 730030,China; 2.Food Testing Center of the Ningxia HuiAutonomous Region,Yinchuan 750000,China)

An analytical method was developed for nitrite determination in dairy products using ion chromatography.Samples were extracted with 0.005 mmol/L NaOH,and protein was precipitated by the mixture of acetonitrile and 3%acetic acid solution with ratio of 1∶1.The eluent was composed of 1.8 mmol/L NaHCO3-and 1.2 mmol/L Na2CO3,and the flow rate was 1.2 ml/min.The analysis was performed on Dionex AS14 separation column,and the conductivity detectorwas used for detection.Results showed thatthe detection limitwas 0.04 mg/kg fornitrite.The recoveries tested by the standard additions method were in the range of 96.8%to 99.4%.The results was compared with the results of GB/T 5009.33—2010,the relative deviation was less than 1%.The method was simple,time-saving,and suitable forthe determination ofnitrite in dairy products.

ion chromatography;nitrite;dairy product;quantitative determination

O658

A

0254-5071（2015）02-0153-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.034

2014-12-02

颜 琪（1964-），女，高级工程师，本科，研究方向为食品质量和安全分析。