桶装纯净水的微生物检测与鉴定

李作美，李 娜，王晓云，于泽权

（蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

桶装纯净水的微生物检测与鉴定

李作美，李 娜，王晓云，于泽权

（蚌埠学院 生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000）

选用成品桶装纯净水为研究对象，成品分别在下线6 h、12 h、24 h、48 h、96 h后进行菌落总数检测，并对其微生物类别进行鉴定，目的是对桶装纯净水中的微生物有针对性地进行预防和控制。结果表明，成品下线6 h后，检测样品时几乎没有微生物的存在，然而随着时间的延长，菌落总数明显的增多。分别对不同的菌落进行分离、纯化并进行鉴别，结果显示有细菌（主要是大肠杆菌）和真菌。

桶装纯净水；微生物；菌落总数；大肠杆菌

快节奏的现代生活使得桶装纯净水走进千家万户，其已经成为人们日常生活中一种方便快捷的饮用水资源。但由于质量参差不齐，纯净水是否真的“纯净”，存在着质疑[1]。

目前我国的桶装纯净水市场抽检合格率低，主要表现在纯净水中微生物数量超标，这在一定程度上给消费者的健康带来危害[2]。由于桶装纯净水在生产、运输和饮用过程中稍有不慎就容易引起污染，其卫生安全值得人们去关注。本实验以某公司生产的桶装纯净水为研究对象，对水样中的微生物进行检测和分离鉴定，旨在为今后桶装纯净水的生产、运输及饮用中制定更加安全的防控措施。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

某公司生产的桶装纯净水。

蛋白胨和酵母浸膏（生化纯），氯化钠、葡萄糖、乳糖、磷酸二氢钾、琼脂、乙醇、碘、草酸铵、碘化钾等（分析纯）：南京博岸生物科技有限公司；溴甲酚紫、伊红、结晶紫、美蓝、沙黄等：南京汇鑫化学试剂有限公司。

细菌培养基；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）、葡萄糖蛋白胨琼脂水培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰（eosinmethylene blue，EMB）培养基[3-7]。

1.2 仪器与设备

DHP-9012恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；YM-50立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；GNP-9080隔水式恒温培养箱：上海三发科学仪器有限公司；B203LED光学显微镜：重庆奥特关学仪器有限公司；CX-204净化工作台：久禾净化技术有限公司；FA1604电子天平：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 水样的稀释[8]

在装有225 mL蒸馏水的灭菌三角瓶内注入25 mL样品，混合均匀，得到10-1的样品溶液。在装有9 mL蒸馏水的灭菌试管中加入1 mL稀释10倍的样品溶液，混合均匀，得到10-2的样品溶液，同样方法制成10-3的样品溶液。

分别吸取10-1、10-2、10-3样品1 mL于无菌平皿内，每个稀释梯度做2个平皿。吸取1mL无菌水加入无菌平皿作空白对照。

1.3.2 菌落总数的测定[9-10]

在适合计数范围内若唯有一个稀释度平板菌落数，则计算两平板菌落数平均值，再乘以相应稀释倍数，获得每毫升样本中菌落总数；在适合计数范围内有两个连续稀释度的平板菌落数，其计算公式：

式中：N为样品中菌落数，CFU/mL；∑C为平板菌落数之和；n1为第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2为第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d为稀释因子（第一稀释度）。

若是每一个稀释度平板菌落数都超过300CFU，就计数稀释度最高的平板，其余平板记“多不可计”，以平均菌落数乘以最高稀释倍数作结果。若是每一个稀释度平板菌落数都低于30，就计算稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数获得结果。若是每一个稀释度（包含样本原液）平板都没有菌落生长，就以小于1乘以最低稀释倍数记录。若是每一个稀释度的平均菌落数均不在30～300范围内，就计算最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数。

1.3.3 大肠菌群的测定

乳糖胆盐发酵试验[11]：在乳糖胆盐发酵管内接种待测样品，每一个稀释度接种三管，37℃培育24h，若乳糖胆盐发酵管均没有产气现象就记录大肠菌群阴性；若产气，即试管中倒置的德汉氏小管中有气泡产生，则继续试验。

伊红美蓝琼脂平板分离[11]：在EMB培养基平板上分别接种产气产酸的培养物，37℃培养18～24h。筛选吻合如下特点：深紫黑色有金属光泽、紫黑色不带或略带金属光泽、淡紫红色中央颜色较深的菌落，涂片。

革兰氏染色[12]：制片，用结晶紫染色液染色1min后用蒸馏水清洗。涂片烘干用革兰氏碘液作用1min用蒸馏水清洗。涂片烘干用体积分数95%的乙醇脱色约30s，蒸馏水洗。涂片烘干用复染色液染色1min水洗烘干。显微镜观测，染色结果呈紫色的是革兰氏阳性菌，呈红色的是革兰氏阴性菌。

复发酵实验[11]：样本为革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另外一部分，接种到乳糖发酵管，每管能够接种来自同一初发酵管同类型菌落1～3个，37℃培养24h。乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，可记录为大肠菌群阳性。

2 结果与分析

2.1 细菌菌落总数的测定[13]

2.1.1 成品下线6h后桶装纯净水取样培养

成品下线6h后，对纯净水进行取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每一个浓度稀释梯度做2个平行实验，即表1中用序号1和2所表示。采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，放置在37℃培养箱中培养24h，结果见表1。由表1可知，培养基内无菌落生长，各梯度平均菌落数为0，平均菌落总数＜1×10-3CFU/mL。

2.1.2 成品下线12h后桶装纯净水取样培养

成品下线12h后，对纯净水进行取样稀释并培养，在37℃培养箱中培养24h，结果见表2。由表2可知，培养基中存在较少菌落，10-1样品的平均菌落数为40～50CFU/mL，其他稀释度平均菌落数为0，样品中平均菌落总数为45CFU/mL。

2.1.3 成品下线24h后桶装纯净水取样培养

成品下线24h后，从同一批次的纯净水中取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每个浓度做2个平行试验，采用细菌培养基制成平板，放置在37℃培养箱中培养24h，结果见表3。由表3可知，培养基中菌落数量明显增加，10-1样品平均菌落数33CFU/mL，10-2样本平均菌落数13CFU/mL，10-3样本平均菌落数6CFU/mL，样品平均菌落总数335CFU/mL。

2.1.4 成品下线48 h后桶装纯净水取样培养

成品下线48 h后，从同一批次的纯净水中取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每个浓度做2个平行试验，在37℃培养箱中培养24 h，结果见表4。由表4可知，经过培养后观察培养基上菌落较多，10-1样本平均菌落数222 CFU/mL，10-2样本平均菌落数89 CFU/mL，10-3样本平均菌落数24 CFU/mL，样品平均菌落总数225 CFU/mL。

2.1.5 成品下线96 h后桶装纯净水取样培养

成品下线96 h后，取样稀释并培养，在37℃培养基中培养24 h，结果见表5。由表5可知，培养基长满了菌落，10-1样本菌落数多不可计，10-2样本平均菌落数220 CFU/mL，10-3样本平均菌落数33 CFU/mL，样品平均菌落总数2.5×104CFU/mL。

2.2 真菌菌落总数的测定

2.2.1 成品下线6 h后桶装纯净水取样培养

成品下线6 h后，对纯净水进行取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每个浓度做2个平行试验，分别配制酵母菌培养基和PDA培养基来培养酵母和霉菌，经过一段时间的培养后观察培养皿内无酵母菌及霉菌的生长，样品霉菌平均菌落总数＜1×10-3CFU/mL，酵母平均菌落总数＜1×10-3CFU/mL，结果见表6。

2.2.2 成品下线12 h后桶装纯净水取样培养

成品下线12 h后，对纯净水进行取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每个浓度做2个平行试验，经过培养后观察培养皿中有少量霉菌及酵母存在，10-1样本霉菌平均数为3 CFU/mL，酵母菌平均数为5 CFU/mL，其他稀释度无菌落生长。样品霉菌平均菌落总数30 CFU/mL，酵母平均菌落总数45 CFU/mL，结果见表7。

2.2.3 成品下线24 h后桶装纯净水取样培养

成品下线24 h后，对纯净水进行取样并稀释成3个浓度梯度，从表8可以看出，霉菌及酵母菌数量明显增加，10-1样本霉菌平均菌落数56 CFU/mL，酵母菌平均菌落数27 CFU/mL。10-2样本霉菌菌落数11 CFU/mL，酵母菌平均菌落数6 CFU/mL。10-3样本霉菌菌落数5 CFU/mL，酵母菌平均菌落数3 CFU/mL。样本霉菌平均菌落总数560 CFU/mL，酵母平均菌落总数270 CFU/mL。

2.2.4 成品下线48 h后桶装纯净水取样培养

成品下线48 h后取样培养，霉菌及酵母菌数量增加较多，10-1样本霉菌平均菌落数107 CFU/mL，酵母菌平均菌落数135 CFU/mL。10-2样本霉菌菌落数59 CFU/mL，酵母菌平均菌落数39 CFU/mL。10-3样本霉菌菌落数27 CFU/mL，酵母菌平均菌落数15 CFU/mL。样本霉菌平均菌落总数1×103CFU/mL，酵母菌平均菌落总数1.3×102CFU/mL，结果见表9。

2.2.5 成品下线96 h后桶装纯净水取样培养

成品下线96 h后，取样并稀释成3个浓度梯度，分别为10-1、10-2、10-3，每个浓度做2个平行试验，经过培养后观察培养皿中的菌落数。10-1样本霉菌、酵母菌平均菌落数多不可计，10-2样本霉菌平均菌落数163 CFU/mL，酵母菌平均菌落数166 CFU/mL，10-3样本霉菌平均菌落数46 CFU/mL，酵母菌平均菌落数79 CFU/mL。样品霉菌平均菌落总数4.4×104CFU/mL，酵母菌平均菌落总数7.9×104CFU/mL，结果见表10。

2.3 大肠菌群测定

2.3.1 乳糖胆盐发酵试验

成品下线96 h后取样，置乳糖胆盐发酵管内培养，37℃培养24 h，观察乳糖胆盐发酵10-1-1、10-1-2、10-1-3、10-2-2、10-2-3和10-3-2号试管中产气，其余的不产气的记为大肠菌群阴性菌。结果见表11。

2.3.2 伊红美蓝琼脂平板试验

在乳糖胆盐发酵管中，选取德汉氏小管产气的试管，进行取样稀释，然后接种到EMB培养基中，涂布均匀，37℃培养24 h。观察到培养基的表面长满了带有金属光泽的紫色菌落。

2.3.3 乳糖发酵试验

由于乳糖发酵试验不是纯菌发酵而是样品发酵，所以初发酵阳性并不能代表大肠菌群为阳性，要进行验证实验。挑选合适的菌落进行革兰氏染色，同时取相同部位的菌落置于乳糖发酵管37℃培养24 h，结果见表12。

由表12可知，10-1-2、10-2-2和10-2-3号试管中存在大肠菌群。对照MPN检索表可得，样品中大肠菌群1 100 CFU/100 mL。95%可信限下限300 CFU/100 mL，上限3 600 CFU/100 mL。

3 结论

根据GB4789—2010《食品微生物学检验》和GB17324—2003《瓶（桶）装饮用纯净水卫生标准》，采用菌落计数及多管发酵等。对某公司生产的桶装纯净水进行微生物检测鉴定[14-16]。样品采集选择的时间分别为成品下线后6 h、12 h、24 h、48 h和96 h。在纯净水生产工艺中有臭氧杀菌的工序，残留的臭氧有杀菌的功效，加上生产环节符合卫生要求，因此成品下线6 h检测样品时几乎没有微生物的存在。

实验结果表明，桶装纯净水随着存放时间的延长，微生物的菌落总数也随之增多，成品下线12 h后，细菌、霉菌、酵母菌菌落总数及大肠菌群均超过国标要求。分析造成这种现象的原因，有可能是3种情况：一是桶装纯净水在生产过程中杀菌不彻底；二是在运输销售过程中的挤压、碰撞造成桶盖松动；三是开启饮用的过程中受到有菌的饮水机的影响。针对这几种微生物污染的原因，首先应从生产环节加以控制，严格要求从业人员进行无菌操作，制定良好的操作规范，确定关键控制点。对制水车间和灌装车间进行紫外线杀菌，对生产管道和贮水容器、空桶及桶盖进行臭氧消毒。其次在运输销售过程中，要检查桶盖的密封性是否完好，严防过分的挤压、剧烈的碰撞导致桶盖松动。最后在开启饮用前，要对饮水机进行清洗消毒，防止杂菌污染。总之，解决好桶装纯净水在生产、运输和饮用过程中的微生物污染问题，是提高桶装纯净水质量的有效途径。

[1]彭 辉，王燕玲.纯净水微生物问题探析[J].中国质量技术监督，2008 （3）：64-65.

[2]吴平芳，贺连华，刘 涛，等.抽检与送检桶装纯净水微生物污染的调查研究[J].热带医学杂志，2008，8（8）：861-863.

[3]王冬月，沈明珠，吴 叶，等.学校桶装纯净水及饮水机卫生状况的调查[J].环境与健康，2007，23（21）：1970-1971.

[4]蒲 彪，胡小松.饮料工艺学[M].北京：中国农业大学出版社，2009.

[5]黄坤辉，杨维占，苏兰妹.桶装纯净水在生产过程中微生物污染及控制措施的研究[J].疾病监测与控制，2011，5（1）：1-3.

[6]齐克久.市售纯净水微生物污染情况分析[J].中国卫生工程学，2006 （1）：24.

[7]高永慧，张冬青.纯净水质量现状和对纯净水国家标准的建议[J].安徽电子信息职业技术学院学报，2010，9（4）：78-80.

[8]李 勤，李 丁，何玉馨，等.桶装纯净水微生物污染结果分析[J].职业与健康，2003，19（9）：67-67.

[9]周德庆.微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[10]汪 莉.桶装纯净水微生物污染状况调查分析[J].实用预防学，2004，11（1）：133-134.

[11]王利艳.饮用纯净水微生物检验中菌落总数的不确定度评定[J].中国保健营养，2013，5（3）：1554-1554.

[12]黄久红，胡金妹，张 翔.桶装饮用纯净水卫生质量现状[J].中国预防医学杂志，2005，6（2）：159-159.

[13]中华人民共和国卫生部.GB 4789—2010食品微生物学检验[S].北京：中国标准出版社，2012.

[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB 17324—2003瓶（桶）装饮用纯净水卫生标准[S].北京：中国标准出版社，2003.

[15]叶 明.微生物学实验技术[M].合肥：合肥工业大学出版社，2009.

[16]张 岚，接伟光.食品微生物学[M].哈尔滨：哈尔滨工业大学出版社，2014.

Detection and identification of microorganisms in bottled purified water

LIZuomei,LINa,WANGXiaoyun,YUZequan

(Departmentof Biology and Food Engineering,Bengbu University,Bengbu 233000,China)

The totalbacterialcountwas detected and microorganism categories were identified in bottled purified water afteronline production for6 h, 12 h,24 h,48 h,96 h.The main detection purpose was to prevent and control microorganism in pure water process.Test results showed that total bacterial count of samples after online production for 6 h almost had no microorganisms,however,with the extension of time,the totalnumber of colonies increased obviously.Afterseparation,purification and identification ofdifferentcolonies,the results showed thatbacteria(mainly Escherichia coli)and fungiwere founded.

bottled purified water;microorganism;totalbacterialcount;Escherichia coli

TS201.3

A

0254-5071（2015）02-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.036

2014-09-02

蚌埠学院工程研究中心项目（BBXYGC2013C05）；国家级大学生创新创业项目（201411305016）

李作美（1975-），讲师，硕士，研究方向为食品生物技术。