黄酮类化合物的分子修饰与构效关系的研究

黄 鑫，梁剑平，郝宝成(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，农业部兽用药物创制重点实验室，甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃兰州730050;2.中国农业科学院研究生院，北京100081)

黄酮类化合物(Flavonoids)又称类黄酮，是一类重要的天然有机化合物。它广泛存在于自然界的各种植物中，是食物和中草药中的主要成分之一，具有多种多样的生物活性，在数量上被称为天然酚性化合物之最。黄酮类化合物的分子结构主要是指以基本母核为2-苯基色原酮(2-phenylchromone)类的化合物，泛指2个苯环(A环与B环)通过C6-C3-C6连接形成一系列的化合物(图1)。由于C环的不同，将黄酮类化合物分为黄酮类、异黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮、查耳酮类及花色素、黄烷醇类以及它们的一些衍生物。黄酮类化合物自1931年Walz首次从豆奶中提取出大豆异黄酮糖苷以后，国内外学者先后对其各种性质进行了研究，发现它具有许多优良的生物学活性，包括抗氧化活性、抗炎活性、雌激素活性、抗过敏活性、抗肿瘤活性、抗真菌、抗菌活性、清除自由基、抗辐射作用、抗癌和抗肿瘤等［1］，颇受人们的追捧。

1 黄酮类化合物分子修饰方法

天然黄酮类化合物及其衍生物从植物、微生物等中获得，种类达上千种。但是，近年来黄酮类化合物由于溶解度差、生物利用度低等原因在临床上应用不多。为了缓解和改善这些限制因素，目前的研究主要是利用各种分子修饰方法如酶法分子修饰、微生物法分子修饰和化学法分子修饰等技术，对黄酮类化合物进行结构改造，以达到对其功能的增强。在这3种修饰方法中，化学修饰方法由于条件可控、选择性修饰便捷等原因最常被采用;酶法和微生物法反应条件温和，专一性好，可用于大规模工厂化生产。目前，黄酮类化合物的结构修饰主要集中在 C 环2、3位，A 环5、6、7、8位，B 环2'、3'、4'位。各种不同类型的取代基如卤素、烷(氧)基、芳基、吡啶基、氨基、羧基、磺酸基、磷酸基等及其他各种官能团均被引入，以此来丰富其种类，改善其化学性质［2］。

1.1 化学修饰法 由于化学修饰选择多，反应成熟，控制方便，目前采用最普遍的分子结构修饰方法。近来，有一些基于化学修饰的新方法。张骥等［3］利用定量构效关系(QSAR)模型，对木犀草素的功能基团进行取代，研究其结构与功能的关系。研究表明，在木犀草素的C5'位和C8位连接-CH2OH和-NHCH3基团，可通过提供电子使得修饰后分子的最低空分子轨道能量升高而有效提高其生物活性;若在同一位点用-OH基团结构修饰，则可通过降低修饰后分子的水合能而提高木犀草素的生物活性;如果在木犀草素的A、B、C环可取代位点上任意取代两个基团生物活性总优于一个取代基团的活性，而如果在A、B、C环上的基团取代位点过多则可能会导致环上活性基团如酚羟基等形成分子内氢键，反而会抑制木犀草素的生物活性。这种利用数学模型的方法，将黄酮类化合物的各个位点取代情况用数学公式计算出来，不仅直观可信，减少试验的盲目性，而且节约时间和资源，可能会给研究化合物分子改造提供新的思路和方法。

1.2 酶修饰法 黄酮类化合物可以被来源于自然界的植物细胞、微生物和游离的酶催化进行糖基化修饰。糖苷化后黄酮类化合物能够改善其构效关系，提高溶解性和生物利用度。Hye等［4］在糖基转移酶和蔗糖合成酶的融合蛋白(Os-UGT3-AtSUS fusion protein)存在下，糖基供体为UDP-葡萄糖，将槲皮素(30 mg/L)进行糖基化，得到槲皮素-7，3'-二-O-葡萄糖苷。Shimoda等［5］以来源于甘薯(Ipomoea batatas)植物细胞的酶，可以将橙皮素的3'位、7位和5位羟基糖基化，将其转变为橙皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、橙皮素-3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、橙皮素-5-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3种橙皮素糖苷，橙皮素(0.45 g/L)总转化率为52%。

任亮等［6］在操作温度为25℃下，利用右旋糖酐蔗糖酶在浓度30%DMSO-浓度70%乙酸-乙酸钙(0.02 mol/L，pH 5.4)的反应体系进行试验，催化合成一种槲皮素葡萄糖苷。在上述体系中，以浓度10%蔗糖为酶催化反应的糖基供体，以槲皮素为糖基的受体，当右旋糖酐蔗糖酶活力为40 U/ml，转速为150 r/min时，槲皮素糖苷的转化率最高，可达39.5%。在上述条件下，槲皮素主骨架上的5个羟基可能都被糖基化。

Park等［7］将从成熟的橘皮中提取出来的黄酮类化合物柚皮芸香苷(Narirutin)和橙皮苷(Hesperidin)进行分离纯化，以从产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter)中提取的葡萄糖转移酶(CGTase)和从青霉菌中提取的橙皮苷酶这2种市售酶为催化剂，以环糊精为糖基供体，催化上述2种黄酮类化合物进行糖基化反应，得到柚苷基-7-O-葡萄糖苷(CFs-glc)和橙皮素-7-O-葡萄糖苷。试验表明，经过酶法修饰的这2种物质具有优良的保肝功能。此外，它们的抗氧化、抗炎作用明显增强。随着代谢组学和酶组学的发展，黄酮化合物的酶糖基化依然成为热点研究项目。由于酶修饰法的高效性、专一性以及高转化率等特点，该方法有望在黄酮化合物工业化转化大生产中被应用。

1.3 微生物修饰法 天然黄酮类化合物主要通过植物提取，提供大量植物的原料，而且易受季节和地域的影响，产率、纯度也很低，且废弃物对环境的影响很大。但是，随着合成生物学与代谢工程的发展，黄酮类化合物新的生物合成代谢途径被建立，现已有用大肠杆菌、酵母等微生物来合成黄酮类化合物及其衍生物的研究，并且在此基础上可以利用上述酶分子修饰法，将其甲基化或糖基化修饰以增加新的生物活性功能。

黄酮类化合物在植物体内的合成途径是一个复杂的酶促反应过程，而其他的黄酮类化合物及衍生物都是在体内以二氢黄酮为前体转变而来的;黄酮类化合物在生物体内合成的途径较短，所以适合在微生物中合成［8］。Santos等［9］利用基因工程的方法，将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)RgTAL和密码子优化后的Sc4CL操纵子构成上游模块，将拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtCHS和葛根(Pueraria lobata)PlCHI构成下游模块，用trc和GAP启动子协调模块表达，以酪氨酸前体，工程大肠杆菌进行发酵生成0.61 mg/L柚皮素。Leonard 等［10］将表达 Pc4CL2、PhCHS 和 MsCHI的底盘大肠杆菌中引入发光杆菌(Photorhabdus luminescens)Pluacc和生物素连接酶(Biotin-protein ligase，birA)基因birA后，以对香豆酸为前体，可生成383 mg/L柚皮素，是出发菌株产量的12.6倍，如果再引入大肠杆菌丙二酰辅酶A合酶(malonyl coa synthase，ACS)基因acs，且在添加乙酸的条件下，可将柚皮素的产量提高到429 mg/L。目前，国内进行黄酮类化合物微生物合成的主要有陈坚等［11］课题组对二氢黄酮类的合成。主要工作是将N端膜结构域经过改造的非洲菊GhF3'H与长春花细胞色素P450还原酶(CPR)基因CrCPR构成融合蛋白，并与 RgTAL、Pc4CL、PhCHS、MsCHI、谷氨酸棒状杆菌accBC等和大肠杆菌内源性乙酰辅酶A合酶(ACS)基因acs一起导入到工程大肠杆菌中，并保证各基因的表达，以酪氨酸为前体物质，最后生成产量达106.7 mg/L圣草酚。随着代谢组学和基因工程学的发展，利用大肠杆菌、酵母菌等模式生物合成天然产物，因其操作快捷简单、生产效率高、低成本、对环境影响小等众多优势而成为研究热点。

2 黄酮类化合物分子修饰与功能的关系

黄酮类化合物生物活性作用广泛，有抗菌、抗病毒、抗氧化、消除自由基等一系列药理作用。这也对应着它结构的多样性。用分子修饰的方法可以改变其原有结构或构象，增加或修改化合物的活性基团或部位，达到扩展黄酮类化合物生理作用功能、提高生物利用度及溶解度的作用，已引起国内外学者的关注，相关研究也都展开，但其结构的改变也有可能对其生理活性产生不利的影响。

2.1 抗菌作用 黄酮类化合物具有优良的抗菌活性，而且由于它不易产生耐药性，在自然界中广泛存在，逐渐成为研究的热点。有文献报道，富含黄酮类化合物的天然产物具有良好的抗菌作用，且对耐抗生素的细菌依然敏感［12-13］。杨彩霞等［14］综述了黄酮类化合物抑制甚至杀死细菌的作用机制主要是通过抑制三羧酸循环阻断能量摄取、增加细胞膜通透性、破换细胞完整性、抑制细胞内酶的活性和蛋白质的合成、抑制核酸合成等。

黄酮类化合物3，4'，5-三羟基-3'，3-二甲氧基黄酮对大肠杆菌的MIC为31.25 μg/ml，鼠李柠檬素比该化合物仅在3'位上少一个甲氧基，其他结构相似，鼠李柠檬素对大肠杆菌则没有抑制效果。这一现象显示该黄酮类化合物的抗大肠杆菌作用的构效与其3'-甲氧基的存在有关［15］。

Wu等［16］为了探究黄酮类化合物抗菌作用与膜的相互关系，选用了11种黄酮类化合物(其中包括2种聚甲氧基黄酮和4种异黄酮)，观察对大肠杆菌的抑制情况，发现黄酮类化合物对大肠杆菌的抑制作用程度不同，其抗菌活性从强到弱依次为山柰酚＞槲皮素＞白杨素＞木犀草素＞黄芩苷＞红橘黄酮＞5，6，7，4'-四甲氧基黄酮，黄豆苷＞染料木苷＞芒柄花苷＞葛根素。研究表明，抗菌活性最强的山柰酚、槲皮素、白杨素的 MIC50值分别是25.00、35.76、36.72 μg/ml，而异黄酮芒柄花苷和葛根素的MIC50值分别为712.5、1 500.0 μg/ml。这说明黄酮类化合物的分子结构比异黄酮化合物更适合抑菌作用。研究者采用QSAR(定量构效关系)模型，并结合试验结果对黄酮类化合物的构效关系进行推测，发现①黄酮类化合物环上3位的羟基对其抗菌活性有重要作用;②甲氧基能够降低黄酮类化合物的抗菌活性，具体体现在红橘黄酮和5，6，7，4'-四甲氧基黄酮A环和B环上有4～5个甲氧基，导致其抗菌活性较低，但是A环8位上的甲氧基能增强黄酮类化合物的抗菌作用;③4种异黄酮中黄豆苷的抗菌活性最高，推测可能是由于A环7位和8位上糖苷化使其抗菌活性减弱。

Ward等［17］发现，黄酮类化合物的卤代也影响其活性，若B环卤代抑菌活性增强，A环的卤代则抑菌活性降低。研究显示，黄酮类化合物B环上3位和4位的氯代以及4'位上的溴取代对金黄色葡萄球菌的抑菌能力与其母体化合物相比提高了1倍，对大肠杆菌的抑菌能力提高4倍。另外，溴代后得到的3-甲基-6-溴黄烷酮与母体相比抑菌作用减弱，表明A环上的卤代可能减弱其抑菌能力。

Brunskole等［18］测定了27种母核结构不同的黄酮类化合物对大肠杆菌模型中重组3HNR(黑色素生物合成酶的活性)的抑制活性。结果显示，鸡豆黄素A在半抑制浓度为12 μmol/L时活性抑制活性最强。构效关系研究表明，黄酮类化合物母核A环上第5位和第7位的羟基与抑制活性有关，C环上第3位和A环上第6位以及B环上第3'位的羟基取代后抑制活性减弱。

2.2 抗病毒作用 黄酮类化合物的抗病毒作用广泛，现已报道的有抗流感病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV病毒)、呼吸道合胞病毒、脊髓灰质炎病毒和辛德毕斯病等。其抗病毒的机制主要是通过阻断病毒对宿主细胞的吸附、穿入、复制等环节增强机体免疫功能，刺激机体的免疫系统产生干扰素、白介素等细胞因子，增强机体免疫功能而发挥抗病毒作用［19］。

Liu等［20］利用25种黄酮类化合物对3种流感病毒(NAs)的抑制作用，揭示黄酮类化合物的构效关系。这3种NAs分别是 A/PR/8/34(H1N1)、A/Jinan/15/90(H3N2)和B/Jiangshu/10/2003。通过该试验结果，可推测出黄酮类化合物抑制NAs潜能排序为橙酮＞黄酮/黄酮醇＞异黄酮＞二氢黄酮/二氢黄酮醇、黄烷/黄烷醇。构效关系研究说明，在黄酮类化合物A环的7位羟基、B环的4'位羟基、C环4位羰基和2，3位双键都是其活性必需基团，糖基化会极大地降低其对NAs的抑制活性。为了证实这些推测，该试验采用致细胞病变效应法CPE测试上述8种化合物的体外抗病毒活性。试验结果与所推测的构效一致。

Ryu等［21］从柘树(Cudrania tricuspidata)中提取了6 种天然黄酮类化合物，测定其对NAs活性抑制的IC50值，并且利用计算机的方法对其进行构效关系研究。这6种化合物与流感病毒NAs作用的关键基团是B环上间苯二酚取代，此外还有A环的极性取代基团。极性取代基团的作用是与NAs受体的活性部位形成氢键，抑制其活性。

Chen等［22］将槲皮素-3-β-半乳糖苷合成该化合物新的衍生物，通过测定其对SARS-CoV 3CLpro的抑制活性，推断槲皮素A环第7位上的羟基取代可增强该衍生物的抑制活性，而且在第7位上取代一个较大的糖苷基。该衍生物仍有抑制活性，但是糖取代基若被乙酰化后抑制活性会降低。

2.3 抗氧化作用 黄酮类化合物具有良好的抗氧化作用、抗衰老作用，一直受人们所推崇。其抗氧化机制主要通过抑制和清除自由基和活性氧来避免氧化损伤。研究槲皮素、茶多酚、儿茶素、木犀草素、芦丁等构效关系，发现天然黄酮类化合物中含有较多的羟基，具有较强的清除自由基的能力，相邻羟基取代基数目越多，活性越强;羟基的糖基化或甲氧基取代都对其抗氧化作用不利，而且B环上的羟基活性比A环更大［23］。

Das等［24］概括了黄酮类化合物抗氧化的作用机制，即①黄酮类化合物与许多酶的相互作用;②清除活性氧自由基的能力;③螯合金属离子的能力;④与其他抗氧化剂的协同或增效作用。此外，黄酮类化合物的自身结构和A、B、C环上取代基的数目和位置也与其抗氧化作用密切相关。虽然各种黄酮类化合的抗氧化特性都已经被发现，但很少有研究系统地对其抗氧化活性与构效关系做深入探讨。Das等利用改造的定量构效关系模型QSAR系统地对黄酮类化合物结构、取代基数目、位置做了分析，发现采用QSAR模型计算推测的黄酮类化合物抗氧化能力的结果与试验结果相似，最后确定出20种黄酮类化合物的抗氧化活性最高。

Cai等［25］用改良的ABTS·+和DPPH的方法测定了从具有抗癌作用的中草药中提取的91种天然黄酮类化合物及其衍生物的清除氧自由基活性，发现其中有许多具有强的清除氧自由基的活性，而另外一部分并无此活性。经过对具有强活性化合物的构效关系的研究，发现黄酮类化合物清除氧自由基活性的相关基团是母核上羟基取代基的数目和位置，相邻位点羟基取代基数目越多活性越强，取代基数目越少活性越弱，甚至没有活性;A环、B环上的邻苯二羟基和C环3位的-OH、-CO取代基是重要活性基团;黄酮类化合物母核骨架中心的吡喃环氧化情况影响其抗氧化活性，C环上的双键和羰基如果共轭则有利于母核骨架结构的稳定;羟基取代基的糖基化和甲基化均会降低黄酮类化合物抗氧化活性，取代基的数目和结构也会影响黄酮类化合物的抗氧化活性。

Amaral等［26］从两种常用的抗癌和抗炎中草药中提取分离了两种黄酮类化合物的活性成分，采用ABTS/HRP和DPPH方法探究黄酮类化合物抗氧化活性与清除自由基功能相关的构效关系。研究表明，这一系列的黄酮类化合物的抗氧化活性与结构的关系是其活性与黄酮类化合物母核中B环上3'，4'邻位二羟基取代、B环与C环的功能基团之间的共轭效应和3位和5位羟基取代基与羰基之间的共轭效应等有关。

Sadeghipour等［27］为了研究黄酮类化合物的抗氧化活性，将过氧化亚硝酸盐与11种天然黄酮化合物反应来研究其抗氧化活性能力，并且得到构效关系。试验中选用天然黄酮类化合物，儿茶素、黄衫素、木犀草素、槲皮素和杨梅素为第一组，因为这些化合物的B环上3'，4'位为邻二羟基，抗氧化活性最高;第二组选用的是柚皮素、山柰酚和桑黄素等，这些化合物因其B环上4'位为羟基取代基，抗氧化活性较前一组弱。比较这两组化合物的反应活性，发现第二组的活性比第一组弱50%，由此可以推测这两组化合物中可能含有相同的活性必需基团。经分析，可以确定为B环上的羟基取代基，即B环上3'，4'位邻二羟基和4'位羟基取代基是抗氧化活性的活性必需基团。另外，发现若B环3'位上羟基取代后使其抗氧化活性减弱甚至消失，而C环上2，3位双键和4位羰基的影响不太明显。

Modak 等［28］从一种植物(Heliotropium sinuatum)的渗出液中提取出黄酮类化合物，发现其抗氧化活性的构效关系，即黄酮类化合物母核骨架上羟基取代基的数目和位置至关重要，B环上3'，4'位羟基取代的黄酮化合物活性最高，这类化合物脱氢作用的ΔH值最低。经过分析，可知C环上2位、3位的双键有利于氧化后自由基的稳定。

2.4 抗炎作用 饶澄等［29］综述了黄酮类化合物的抗炎作用机制主要通过对花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)代谢酶及其代谢产物等炎症递质产生抑制作用;通过降低基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)以及减少血管内皮生长因子(Vascular endot helial growth factor，VEDF)表达等方式抑制血管生的生产;抑制补体-中性粒细胞-活性氧正反馈活化环控制炎症应答等途径发挥其抗炎作用的。

脂氧化酶(Lipoxygenase，LOX)被认为是风湿性关节炎、肠炎、牛皮癣、过敏性鼻炎、动脉硬化和某些癌症等的炎症介质。某些黄酮类化合物具有抑制脂氧化酶活性的功能，因此具有保护血脂不受自由基的破坏即抗炎作用。Vasquez-Martinez等［30］在色原酮骨架C环2位、3位上分别设计连接不同的烷基或芳香基，在其他不同的位点上连上羟基合，最终合成41种异黄酮类衍生物，将这些黄酮类衍生物进行体外试验，研究其抑制人脂氧化酶(hLOX)同工酶12-hLOX、15-hLOX-1和15-hLOX-2的抑制活性。研究结果与槲皮素、黄芩素、漆树黄酮等已知具有hLOX抑制活性的天然黄酮化合物作比较，分析构效关系，发现黄酮类衍生物的抑制活性、选择性与其母核骨架上的芳香性和氧化状态至关重要，对黄酮类化合物进行分子修饰可以使其成为12-hLOX、15-hLOX-1等的选择性抑制剂，发挥其抗炎作用;A环、B环上的邻苯二酚结构是活性必需基团;异黄酮和异黄烷酮对12-hLOX均有抑制作用，而异黄烷酮对15-hLOX-1抑制作用更明显，但对15-hLOX-2抑制作用甚微;不同化合物与受体蛋白的结合方式不同，B环有取代基会因为异黄烷酮C环柔性升高而与受体蛋白的结合方式发生改变，导致其化合物的活性丧失，但是异黄酮和异黄烷酮较前者C环刚性高，B环不易被影响，B环上的抑制活性也不会受到影响。

参与炎症反应的细胞中白细胞渗出是炎症反应最重要的特征。消除炎症最普遍的认识是抑制白细胞的活性或形成。Sartor［31］等通过27种黄酮化合物抑制白细胞胰肽酶E和白明胶酶的研究，发现抑制白细胞胰肽酶E活性的功能基团是3位上的羟基或半酰基、B环上的3个羟基取代、4'位上单羟基取代、2，3位间双键;抑制白明胶酶的作用是由A环或B环的3个羟基和3位的半酰基决定的。Paoletti等［32］以芹菜素为先导化合物，引入异戊烯基合成新的黄酮类衍生物。在这些化合物中8-preny lnaringenin(8-PN)和8-prenylapigenin(8-PA)能够抑制核因子-kB活化和活性氧自由基的累积，从而抑制脂多糖诱导基因的表达水平。黄酮类化合物的抗炎作用主要通过影响细胞的分泌、有丝分裂及细胞间的相互作用来实现的，其构效关系尚不明确。

2.5 其他功能 天然黄酮类化合物的来源丰富，结构多样，功能广泛，受到国内外学者的广泛关注。由于黄酮类化合物能抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞的分化和凋亡等，已成为近来黄酮类化合物研究的新热点。黄酮的抗肿瘤活性结构主要集中在黄酮分子中的B环和C环以及羟基的位置和C2、C3位的双键。适当的羟基，C2、C3位呈双键，B环定位于2、3、6位的羟基，B环邻位羟基等对于植物黄酮发挥抗肿瘤效应可能是至关重要的。此外，黄酮类化合物还有消除自由基、保护心血管、镇痛解痉作用、保肝、泻下、雌激素样作用等生物功能。已有文献报道，这些功能都与黄酮化合物结构上的活性基团的位置和种类有关。所以，利用一些新兴的技术如网络病理学方法等对黄酮类化合物的分子进行设计改造，将会有巨大的潜力［2］。

3 设想与展望

目前对黄酮类化合物的结构修饰改造主要是在A环6、7、8 位，B 环2'、3'、4'位上的活性基团取代作用，如卤素、烷基或烷氧基、芳基、氨基、羧基等，以此法来改善黄酮类化合物的抗菌、抗氧化以及消除自由基等多种活性功能，并且羟基作为取代基的个数和位置对其活性也有影响。而C环2、3位的双键和羰基的修饰对其活性的影响甚大。一般认为，若2、3位的双键和羰基发生加氢反应，则会降低天然黄酮类化合物的生物活性。经综合分析黄酮类化合物的结构信息，将3种修饰方法(化学修饰方法、酶修饰法和微生物修饰法)结合起来，并且辅以计算机设计技术，构建一套完整的有关黄酮类化合物的分离提取、结构改造、构效关系、药理作用研究的综合实验平台，可以更好地为人类健康造福。

天然黄酮类化合物的药理作用广泛，结构复杂。了解和掌握其构效关系与作用基团，对天然黄酮类化合物在临床应用和生产实际中的影响很大。目前，对于天然黄酮类化合物及其衍生物的研究主要是利用各种药物化学实验方法、计算机辅助药物设计等多方面对其结构进行设计改造，以研究其构效关系。人们应该不断利用新出现的技术和方法，研究黄酮类化合物的作用本质，弥补其各种缺陷和不足，以加强天然黄酮类化合物的综合利用价值。

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