华山松松塔提取物抗HIV活性部位中铅含量的测定

张 桢，孙帮燕，郭贵唐，罗建蓉

(1.昆明医科大学附属儿童医院/昆明市儿童医院检验科中心实验室，云南昆明650028;2.大理大学药学与化学学院，云南大理671000)

病原体为人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)的疾病，临床上称其为获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmune deficiency syndrome/AIDS)。如果机体感染HIV，那么机体的免疫细胞功能将会衰退且免疫细胞数量会衰退，导致机体增加恶性肿瘤发生机率或感染，最终导致感染者死亡。HIV不仅严重威胁着人类的健康，而且阻碍全球经济和社会的发展［1］。目前，尽管美国批准上市的HIV的药物有20多种，但是价格昂贵、毒副作用大，作用环节单一，易出现耐药性［2－3］。

松科松属植物资源丰富，全世界约100多种。我国松属植物分布极广，合计50余种(有22种，10个变种，引进16种，2个变种)［4］。据《本草纲目》记载，松塔具有祛痰、祛风、止咳平喘、安神和润肠等功效［5］。在我国，已有13种被列入药用的松属植物，其能入药部位主要为松塔及松子、松针、松脂、松节等。从目前松塔研究报道中发现，松塔中含有多糖、酚类、木质素类、萜类、黄酮类多种化学成分，且发现松塔药理活性具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、增强免疫力等作用［6－8］。

尽管中华人民共和国药典把13种松属植物列入药用，但目前报道松属的松塔药用开发不是很多，尤其关于松塔抗HIV药用的研究报道很少［9］。为此，笔者对采集于云南省巍山县的华山松(Pinus armandii Franch.)松塔进行研究，测定松塔提取物中(抗HIV治疗指数＞30)铅的含量，为进一步研究抗HIV药物质量标准打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料 取干燥的华山松(P.armandii Franch.)松塔(生药学马晓宽教授鉴定)5 kg，粉碎，用一定浓度的乙醇(90%)在室温条件下提取2次(2×9 L)，每次12 h。过滤，残渣用水浸泡提取，过滤后残渣中加碱液(浓度4%氢氧化钠)浸泡提取，过滤，向得到的碱性滤液加入酸(用乙酸调pH)，浓缩到适量体积，加入乙醇混匀，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅰ;在滤液中继续加醇液，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅱ;滤液中再加醇液，静置12 h，过滤得到粗提取物Ⅲ。

1.2 试验方法

1.2.1 测定条件。波长为 283.1 nm［5］;背景校正为塞曼效应;狭缝 0.7 nm;样品进样量 17 μl，0.5% 基体改进剂硝酸镁和硝酸钯的混合液3 μl，高纯氩气为保护气(250 ml/min)。升温程序(表1):第1次干燥温度110℃，坡升时间1 s，持续时间30 s;第2次干燥温度130℃，坡升时间15 s，持续时间30 s;灰化温度850℃，坡升时间10 s，持续时间20 s;原子化温度1 600℃，坡升时间0 s，持续5 s;净化温度2 450℃，坡升时间1 s，持续时间3 s。

表1 升温程序

1.2.2 铅标准储备液和标准使用液的制备。精密量取铅单元素标准液(GB08619)适量，用浓度2%硝酸溶液稀释，即得1 μg/ml铅标准储备溶液，冰箱中0～5℃保存［5］。精密量取铅标准储备液适量，用浓度2%硝酸溶液稀释，配制400 ng/ml标准使用液(用时现配)。

1.2.3 标准曲线的制备。分别精密量取铅标准使用液0、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 ml于 25 ml容量瓶中，用浓度2%硝酸溶液定容至刻度，摇匀，即得0、5、10、20、40、80、160 ng/ml的溶液。按“1.2.1”用自动进样器自动进样，于石墨炉原子吸收光谱仪上测试。扣除试剂空白，以吸光度值(A)对铅浓度(C，ng/ml)做线性回归处理，回归方程为:A=0.002 85C+0.003 93，相关系数(r)=0.999 0，线性范围为0 ～200 ng/ml。

1.2.4 样品测定。参照中华人民共和国药典［2010版附录Ⅸ B 铅、镉、砷、汞、铜测定法(一部)(B 法)］处理标本［5］，分别精密称取3种抗HIV活性部位(治疗指数＞30)［4］样品0.20 g，置三角瓶中，加硝酸/高氯酸(4∶1)10 ml，瓶口加一小漏斗，浸泡过夜，在通风厨里置电热板上加热消解，保持微沸，直至浓烟散尽，消解液呈透明，再加去离子水，待白烟散尽，定容至25 ml。同时，制备空白液，按测定条件进行测定。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验。取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，重复测定吸光度6次。表2表明，样品Ⅰ～ⅢRSD 分别为1.50%、1.77%、1.53%，说明该方法精密度良好。

表2 精密度试验

2.1.2 稳定性试验。取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，每隔20 min测定一次吸光度。表3表明，2 h内颜色变化较小，不影响测定。

表3 稳定性试验

2.1.3 回收率试验。采用加标回收法，取松塔样品Ⅰ～Ⅲ，加入 0.5 ～2.0 倍标准品，按“1.2.4”项中的方法和步骤进行操作，测定其吸光度，并且计算回收率。表4表明，平均回收率为99.79%，RSD 为 4.45%。

表4 回收率试验结果

2.1.4 方法检出限。参照中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》［10］，该法检出限为 5.0 μg/kg。

2.1.5 评价结果。采用《中国药典》［5］(2010 年版)和中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》［10］重金属最高限定的标准评价。结果表明，提取物Ⅰ～Ⅲ铅含量分别为3.41、2.71、2.92 mg/kg，低于中华人民共和国对外经济贸易合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》(Pb≤5.0 mg/kg)和《中国药典》(2010年版)重金属最高限定的标准(Pb≤5.0 mg/kg);超标率为0。

3 讨论

在取样和样品消解过称中，所有玻璃仪器均需以16.67%硝酸浸泡过夜，用水反复冲洗，最后用去离子水冲洗，以免污染试样。石墨炉原子吸收光谱分析法是一种灵敏度高、适合测定铅的测试技术，但是存在基体干扰严重等缺点，故在石墨炉原子吸收分光光度分析工作中，应注意背景和其他原因引起的对测定结果的干扰。如，仪器工作原子化条件可能影响仪器的灵敏度、稳定程度。试验中，选择塞曼效应为背景校正系统［7］。该研究表明，浓度0.5%硝酸镁和硝酸钯是一种良好的基体改进剂，因此在校准曲线和标本测试过程中，设置自动进样器同时加入改进剂，就可以满足测定需要，减少测试步骤，避免基体干扰测试结果。按提取工艺对采自于云南省巍山县的华山松(Pinus armandii Franch.)松塔进行处理，得到抗HIV活性部位铅含量没有超标。

［1］刘武青，李磊珂，郑永唐，等.中药复方凉茶提取物体外抗HIV活性研究［J］.中药材，2010，33(9):1433－1437.

［2］张桢，张鹏，刘光明，等.华山松松塔中抗HIV活性部位多糖的含量测定［J］.时珍国医国药，2010，21(10):2435－2436.

［3］刘光明，吕永俊，李好枝，等.云南松松塔中抗HIV活性成分研究初报［J］.大理学院学报，2009，8(2):69.

［4］郑万均.中国树木志［M］.北京:中国林业出版社，1983:148.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010版［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［6］NAGATA K，SAKAGAMI H，HARADA H，et al.Inhibition of influenza virus infection by pine cone antitumor substances ［J］.Antiviral Res，1990，13(1):11－21.

［7］FUKUCHI K，SAKAGAMI H，IKEDA M，et al.Inhibition of herpessimplex virus infection by pine cone antitumor substances［J］.Anticancer Res，1989，9(2):313－317.

［8］OH-HARA T，SAKAGAMI H，KAWAZOE Y，et al.Antimicrobialspectrum of lignin-related pine cone extracts of Pinus parviflora Sieb.et Zucc［J］.In Vivo，1990，4(1):7 －12.

［9］张桢，李春艳，刘光明，等.华山松松塔体外抗HIV活性的研究［J］.时珍国医国药，2014，25(1):25－26.

［10］中华人民共和国对外经济贸易合作部.药用植物及制剂进出口绿色行业标准［S］.北京:中国标准出版社，2001.