褐飞虱ABCG基因的克隆与表达分析

闸雯俊，王芳芳，李三和，胡刚，陈志军，刘凯，周雷，杨国才，游艾青

摘要：三磷酸腺苷结合盒转运蛋白（ATP-binding cassette， ABC）广泛分布于各种生物体中，是最大的膜蛋白家族之一。在昆虫中，ABC转运子不仅在分子转运过程中有重要的功能，同时在杀虫剂抗性、代谢和发育中都起到重要的作用。克隆和鉴定了褐飞虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）ABCG基因 （NlABCG），结果表明NlABCG基因全长1 222 bp， 含有一个长度为789 bp的开放阅读框，编码263个氨基酸。NlABCG蛋白与内华达古白蚁（Zootermopsis nevadensis） ABCG的同源性最高，达到69%。利用qRT-PCR 检测NlABCG基因在褐飞虱不同发育阶段和不同组织中的表达，发现NlABCG 转录本在褐飞虱的所有发育阶段都有表达，在1龄若虫中表达量最低，随着生长发育表达量逐渐升高。NlABCG在褐飞虱5龄若虫的中肠中表达量最高。NlABCG基因的序列特征和表达谱非常保守，为其功能的分析提供了信息。

关键词：褐飞虱（Nilaparvata lugens St？覽l， BPH）;NlABCG;克隆

中图分类号：S435        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）23-5871-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn 0439-8114.2014.23.064

ABC 转运蛋白最早发现于细菌，是细菌质膜上的一种具有运输功能的 ATP 酶（Transport ATPase），是一个庞大而多样化的蛋白家族。ABC转运蛋白是膜整合蛋白，它通过利用 ATP 水解过程释放的能量对溶质中各种生物分子进行跨膜转运，其转运的底物包括糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质、细胞代谢产物和药物等[1]。ABC 转运蛋白在生物体内以全分子或半分子转运蛋白的形式存在，全分子转运蛋白由2个核苷酸结合域（Nucleotide  bindingdomain，NBD）和2个跨膜结构域（Transmembrane domain，TMD）构成，每个半分子转运蛋白包括1个NBD和1个TMD，NBD位于细胞质内，在 NBD内有一个约200个氨基酸构成的保守序列，包含了3个保守区域，分别为Walker A（P-loop）、Walker B和特征基序 C（也称 Signature 基序或特征基序S）[2]，其中 Walker A和B是所有的核苷酸结合蛋白所共有的，而Signature基序是ABC转运蛋白特有的。

ABC转运蛋白可以分为转入蛋白、转出蛋白和非转运蛋白[3]。研究表明在昆虫中，ABC转运蛋白的功能已经影响昆虫代谢和发育[4]。褐飞虱（Nilaparvata lugens St？覽l，BPH）属同翅目飞虱科昆虫，又称褐稻虱。褐飞虱是水稻主要害虫之一，在我国长江流域和华南及西南广大稻区发生频繁、危害严重[5]。本研究从褐飞虱体内分离得到NlABCG基因的全长，同时分析了NlABCG基因结构，并对其在发育过程中和不同组织中的表达进行分析， 以期为研究其进化提供新的资料， 为研究褐飞虱NlABCG基因的功能和在ABC转运蛋白中的价值提供依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料  褐飞虱品种（生物型Ⅱ）为武汉大学收藏，饲养在感虫水稻品种台中1号（TN1）植株上，环境条件为（25±2） ℃，80%的相对湿度，光照周期为16 h光，8 h黑暗。

1.1.2  试剂  试验所用大肠杆菌E. coli DH5α， ExTaq酶、逆转录试剂盒和pMD18-T克隆载体，5′-Full RACE 和3′-Full RACE试剂盒购自Takara 公司。引物合成及序列测定由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

1.2  方法

1.2.1  总RNA的提取  使用总RNA提取试剂盒RNAiso Plus提取褐飞虱发育时期和成体不同组织的总RNA。将溶于无核酸酶水中的RNA置于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2  cDNA克隆  利用Tribolium castaneum的ABC transporter蛋白（GenBank登录号： XP_97173

5.1）在褐飞虱的ESTs数据库（http：//bphest.dna.affrc.go.jp/）中进行TBLASTN查询，得到相应的EST片段。以该EST序列为模板设计RACE引物。以提取的总RNA为模板，使用RACE试剂盒分别合成5′和3′RACE cDNA。以合成的cDNA第一链为模板，进行Outer PCR反应和Inner PCR反应，反应引物见表1。Outer PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸2 min， 20个循环后72 ℃再延伸10 min。Inner PCR反应程序与以上程序一样，只是改为30个循环。PCR 产物利用宝生物工程（大连） 有限公司试剂盒回收，与pMD18-T载体连接。阳性克隆由北京擎科新业生物技术有限公司测序。

1.2.3  实时荧光定量PCR检测NlABCG转录差异  取不同生长发育时期褐飞虱和褐飞虱不同组织总RNA，按照反转录试剂盒说明书进行反转录获得褐飞虱的cDNA。在Roteogene 6000TM型定量PCR仪上进行10 μL体系的PCR反应，反应条件如下：94 ℃预变性2 min，然后以30～40个循环进行PCR扩增  （94 ℃ 20 s， 55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s） 每个样品3个重复，取平均值。以褐飞虱Actin作为参照基因，采用2-ΔΔ Ct方法[6]比较不同样品基因表达水平。endprint

1.2.4  生物信息学分析  对5′RACE序列和3' RACE 序列测序后拼接获得cDNA全长。用ExPASy Translate tool软件（http：//web.expasy.org/translate/）进行翻译得到相应cDNA编码框的预测，再利用下列在线工具进行蛋白质序列的功能域及结构域的预测：用Clustalw（http：//www.genome.jp/tools/clustalw/）进行同源序列比对;用MEGA 4.0软件进行进化树的绘制;用ExPASy Compute pI/Mw tool（http：//web.expasy.org/compute_pi/）进行分子量和等电点分析;用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/进行二级结构的预测。

2  结果与分析

2.1  褐飞虱NlABCG基因的克隆

以该EST序列为模板设计RACE引物，克隆得到NlABCG基因（GenBank登录号： KM115648）的5′ cDNA 片段和3′ cDNA片段（图1）。5′cDNA 序列长度约为0.8 kb，3′ cDNA序列长度约为0.4 kb。全长序列经过测序拼接后，全长为1 222 bp，含有一个编码263个氨基酸的开放阅读框（ORF）。

2.2  NlABCG蛋白质分析鉴定

NlABCG基因编码263个氨基酸，结果见图2。应用Computer pI/Mw Tool软件分析预测NlABCG的分子量为28.7 kDa，等电点为6.44。二级结构预测分析发现，NlABCG蛋白质α螺旋占35.74%，延伸链占15.59%，随机卷曲占46.01%（图3）。

通过 NCBI的 Blastp （http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）程序进行在线蛋白质序列比对，结果表明该基因与其他昆虫的ABCG蛋白序列相似性大于63%（表2）。如，与内华达古白蚁（Zootermopsis nevadensis）ABCG1的同源性为69%，与豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）ABCG4和佛罗里达弓背蚁（ Camponotus floridanus）ABCG4的同源性为67%，与切叶蚁（Acromyrmex echinatior）ABCG4﹑毕氏粗角猛蚁（Cerapachys biroi）ABCG和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）ABCG1的同源性为66%，与金小蜂（Nasonia vitripennis）ABCG4的同源性为63%。由此可以看出，褐飞虱NlABCG与其他昆虫的 ABC 转运蛋白序列相似性较高，其序列相当保守。

2.3  NlABCG分子进化分析

用 NlABCG编码的氨基酸序列与蜜蜂、家蚕、人体虱、佛罗里达弓背蚁、豌豆蚜、切叶蚁、内华达古白蚁、赤拟谷盗、毕氏粗角猛蚁、金小蜂中可能的ABCG亚族成员进行聚类分析，结果发现NlABCG与内华达古白蚁、赤拟谷盗和豌豆蚜中可能的 ABCG亚族成员聚类在一起，亲缘关系较近，而与其他昆虫的ABCG亚族成员亲缘关系相对较远（图4）。

2.4  褐飞虱NlABCG基因不同生长发育时期和组织的分析

为了解NlABCG基因在褐飞虱不同生长发育阶段虫体中和在虫体不同组织中的转录情况，分别提取1龄至5龄若虫和雌雄成虫虫体的总RNA以及5龄若虫的中肠、唾液腺、脂肪体、表皮、腿和头部组织的总RNA，利用实时荧光定量PCR法检测该基因在褐飞虱不同发育阶段虫体中和不同组织中的表达情况。试验结果表明，该基因在雌成虫的表达量较高（图5）。不同组织中，在中肠的表达量最高（图6）。

3  小结与讨论

本研究克隆得到NlABCG基因的全长，并且将氨基酸序列与其他昆虫的ABCG进行序列比对，发现其与内华达古白蚁、赤拟谷盗、豌豆蚜的ABCG蛋白在进化上亲缘关系较近。对褐飞虱ABCG蛋白序列进行分析发现，该蛋白质α螺旋占35.74%，延伸链占15.59%，随机卷曲占46.01%。同时鉴定了NlABCG基因在褐飞虱不同生长发育阶段虫体和在虫体不同组织中的转录情况，该基因在雌性成虫中的表达量较高。在不同组织中，在中肠的表达量最高。中肠组织是昆虫肠道组织中惟一与细胞表面直接接触的。研究表明，家蚕中的ABCG基因是特异表达的，在蜕皮和化蛹期间受20E正调节[7]。

因此，褐飞虱NlABCG基因的表达特征表明，利用农药防治褐飞虱的最佳时期是在早期。这些结果有利于开发一些以NlABCG基因为靶标的安全有效的杀虫剂，同时可以利用RNA干扰的方法来抑制ABC转运蛋白的表达，以达到控制害虫的目的。

参考文献：

[1] 王华丙，张振义，包  锐，等.ABC转运蛋白的结构与转运机制[J].生命的化学，2007，27（3）：208-210.

[2] 吴转斌，吴金美.ABC转运子G亚族与人类疾病[J].江苏大学学报（医学版），2008，18（3）：861-866.

[3] SAURIN W， HOFNUNG M ，DASSA E. Getting in or out： Early segregation between importers and exporters in the evolution of ATP-binding cassette （ABC） transporters[J]. J Mol Evol，1999，48：22-41.

[4] VACHE C， CAMARES O， CARDOSO-FERREIRA M C， et al. A potential genomic biomarker for the detection of polycyclic aromatic hydrocarbon pollutants： Multidrug resistance gene 49 in Drosophila melanogaster[J]. Environ Toxicol Chem，2007， 26：1418-1424.

[5] 王传之，于  洁，裴庆利，等.水稻品种抗稻褐飞虱育种的研究进展[J].安徽农业科学，2008（8）：3170-3173.

[6] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method[J].Methods，2001，25（4）：402-408.

[7]  LIU S， ZHOU S， TIAN L， et al. Genome-wide identification and characterization of ATP-binding cassette transporters in the silkworm，Bombyx mori[J].BMC Genomics，2011.DOI：10.1186/1471-2164-12-491.endprint