HPLC法对细梗香草中槲皮素和山奈酚含量的测定

林贵兵，罗光明，许燕萍，沈安，谢安芮，刘勇

摘要：测定了细梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）中槲皮素和山奈酚含量。用甲醇加热回流盐酸水解法，薄层色谱对细梗香草提取液中槲皮素和山奈酚进行定性检验;高效液相色谱法（HPLC）同时测定细梗香草中槲皮素和山奈酚含量，色谱条件为ACI C18（250 mm×4.6 mm）色谱柱，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为368 nm，柱温为30 ℃。槲皮素在0.24～2.40 μg内线性关系良好，回归方程为y=0.000 3x-0.006 1，R2为0.997 8，平均回收率为95.91%;山奈酚在0.72～7.20 μg内线性关系良好，回归方程为y=0.000 2x+0.411 5，R2 为0.997 2，平均回收率为103.06%。细梗香草中槲皮素和山奈酚含量在分别为0.021%与0.065%。

关键词： 细梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.）;槲皮素;山奈酚;HPLC

中图分类号：O657.7+2      文献标识码：A       文章编号：0439-8114（2014）23-5848-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.23.057

细梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl.） 又名满山香，为报春花科植物全草，具有清热解毒、祛风、止咳、调经、宁神等功效，临床主要用于感冒咳嗽、风湿痹痛、气管炎、哮喘、月经不调、神经衰弱等[1]。现代药理研究表明，细梗香草具有解热、抗病毒、抗肿瘤等作用。细梗香草中有效成分以黄酮和皂苷为主，还有有机酸、挥发油等[2-6]。吕武清等[7]对细梗香草药材测定黄酮苷元山奈酚的含量为0.015%～0.085%。唐琍萍等[8]优化了样品处理方法同时测定槲皮素和山奈酚含量分别为0.006 1%和0.107 0%。因这些方法都采用层析柱对提取液黄酮苷元进行了纯化富集，其成分损失较大。本研究采用直接提取法，减少提取工艺对有效成分的损失，优化提取过程，提高效率，节约成本，并用HPLC法测定细梗香草槲皮素、山奈酚含量，使结果更客观准确。本研究通过测定细梗香草全草中槲皮素与山奈酚含量，为其质量标准的制定提供基础数据。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1100型高效液相色谱仪（Agilent公司），配二极管阵列检测器（DAD）;AB104-N型电子天平（德国Mettler-Toledo公司）;薄层色谱硅胶G（青岛海洋化工有限公司）;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯;试验用水为去离子水。

槲皮素标准品（批号：20130522，上海金穗生物科技有限公司）与山奈酚标准品（批号：110861-201209，中国食品药品检验研究院），药材经刘勇副教授鉴定为报春花科珍珠菜属植物细梗香草（Lysumachia capillipes Hemsl.）的干燥全草（图1）。

1.2  含水量测定

取细梗香草药材，粉碎后过80目筛，精密称取粉末2.0 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖至105 ℃干燥5 h，盖好瓶盖后移至干燥器中，冷却30 min，再次精密称定。再于105 ℃干燥1 h，冷却后称重，直至连续两次称重，重量差不超过5 mg，计算药材中含水量（%）。

1.3  供试品制备

取细梗香草药材全草同一批次粉末2.0 g，精密称重置于具塞的玻璃瓶中，精密加入25 mL甲醇，精密称重，置水浴中加热回流1 h，冷却后称重，补足损失甲醇并混匀;过滤并取滤液10 mL，水浴蒸干，用20 mL甲醇溶解，加入2 mL浓盐酸，置水浴中加热回流水解1 h，蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜后即为供试品溶液。

1.4  对照品制备

精密称取槲皮素标准品2.4 mg，山奈酚标准品7.2 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀溶解，浓度分别为槲皮素对照品（Q）0.24 μg/μL、山奈酚对照品（P）0.72 μg/μL，冷藏备用。

1.5  薄层色谱

取供试品、槲皮素与山奈酚对照品溶液10 μL分别点于硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）为展开剂，置盐酸蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干。

1.6  色谱系统考察

1.6.1  色谱条件  色谱柱为ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为368 nm，柱温为30℃。对照品进样量为20 μL。

1.6.2  线性关系考察  分别精密进样槲皮素与山奈酚混合标准品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在上述色谱条件下测定峰面积，将其含量与峰面积进行处理。y表示含量，x表示峰面积;分别得到线性关系和相关系数。

1.6.2  精密度试验  精密吸取样品溶液20 μL，按上述色谱条件重复进样6次，分别计算槲皮素与山奈酚峰面积RSD值。

1.6.3  稳定性试验  精密吸取同一供试品溶液20 μL，按上述色谱条件，在0、1、2、3、4、5 h测定槲皮素与山奈酚峰面积，分别计算其RSD值。

1.6.4  重复性试验  取同一批样品6份，制成供试品溶液，精密吸取20 μL，按上述色谱条件测定槲皮素和山奈酚峰面积，分别计算其RSD值。endprint

1.6.5  加样回收率试验  称取2.0 g细梗香草药材粉末，加入5 μL标准品溶液，在“1.3”项操作下制成供试品溶液，每次吸取20 μL，按上述色谱条件进行测定和分析，分别计算槲皮素和山奈酚平均回收率和RSD值。

2  结果与分析

2.1  含水量

按照2010版药典规定的方法，对细梗香草全草含水量测定结果为12.43%。

2.2  薄层色谱结果

薄层色谱结果如图2所示，可见在“1.5”条件下，山奈酚与槲皮素分离效果较好，说明“1.3”中供试品制备条件能提取并水解出山奈酚与槲皮素，展开系统合适分离山奈酚与槲皮素。

2.3  HPLC系统

线性关系考察结果表明，槲皮素在0.24～2.40 μg内线性关系良好，回归方程为y=0.000 3x-0.006 1，R2为0.997 8;山奈酚在0.72～7.20 μg内线性关系良好，回归方程为y=0.000 2x+0.411 5，R2为0.997 2。精密度试验表明，槲皮素与山奈酚RSD值分别为1.376%、0.367%，说明精密度良好。稳定性试验结果其RSD值分别为1.51%、1.99%，表明在5 h内样品比较稳定。重复性试验中槲皮素的峰面积分别为2 014.3、2 039.1、2 068.6、2 022.3、2 040.0、2 016.8，山奈酚峰面积分别为11 310.9、11 353.1、11 869.9、11 386.6、11 933.0、11 481.2，其RSD值分别为1.00%、2.34%。加样回收率结果槲皮素和山奈酚平均回收率分别为95.91%、103.06%;RSD值分别为 2.76%、1.12%，结果见表1。

2.4  对照品分离

在“1.6.1”色谱条件下，进样对照品结果（图3）表明，槲皮素和山奈酚的保留时间分别为5.4 min和8.1 min，分离效果较好。

2.5  供试品HPLC图谱

精密吸取供试品溶液20 μL，在“1.6.1”色谱条件下测定，色谱图结果如图4所示。

2.6  细梗香草槲皮素、山奈酚含量

本研究对药材进行了槲皮素与山奈酚含量的测定，结果槲皮素和山奈酚含量分别为0.021%和0.065%。

3  小结与讨论

3.1  提取工艺方法

细梗香草主要有效成分包括黄酮类和皂甙类，以前学者研究黄酮类物质主要采用了柱层析方法富集黄酮类成分，此方法除去了非黄酮类成分，但对黄酮类成分损失较大，本研究采用直接提取盐酸水解法，损失相对较小，对含量测定相对较为客观准确。

在用60%、80%、100%甲醇分别进行提取，结果表明纯甲醇提取槲皮素、山奈酚提取率最高，水浴加热时间比较了30、60、90 min提取效果，结果表明提取时间差异不显著，本课题采用了用纯甲醇与水浴加热60 min。

药材粉末粗细程度对含量测定的影响，比较了过100、80、60目筛以及粗粉比较，结果表明过100目与80目对有效成分提取含量差异不显著，而60目以及更粗的粉末几乎无法提取出黄酮类成分。因此对于细梗香草黄酮类有效成分提取药材粉末至少要过80目筛。

3.2  色谱条件

吕武清等[7]测定山奈酚色谱条件;流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53，V/V）;流速：1.0 mL/min条件下，山奈酚在约8.6 min处出峰。唐琍萍[8]等测山奈酚与槲皮素的条件;流动相：甲醇-水-磷酸（500∶500∶1，V/V/V） 条件下槲皮素在约9.4 min出峰，山奈素在约16.2 min有一色谱峰。本试验用色谱柱为ACI C18（250 mm×4.6 mm）柱，修改流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（60∶40，V/V），流速为1.0 mL/min，检测波长为368 nm;柱温为30 ℃;进样量为20 μL。在此色谱条件下，槲皮素和山奈酚的保留时间分别为5.4 min和8.1 min，缩短了出峰时间，提高了效率，节约了试验成本。

3.3  小结

细梗香草中皂苷类成分研究比较清楚，而黄酮类成分研究不多，在药材中它主要以黄酮苷的形式存在，水解为黄酮苷元后，药材化学成分特异性不强，需进一步深入研究黄酮类化学成分。细梗香草叶的黄酮类成分含量比茎高，具有显著差异，这也与采收期密切相关，因此本课题组下一步研究细梗香草不同采收期药材的含量差异，其成分动态积累的规律，研究其最佳时间，为细梗香草质量控制提供基础依据。

参考文献：

[1] 江西省卫生厅.江西省中药材标准[M].南昌：江西科学技术出版社，1996.

[2] 谢  忱，徐丽珍，赵保华，等.细梗香草化学成分的研究[J].中草药，2000，31（2）：81-83.

[3] 丁智慧，丁靖恺，易元芬，等.细梗香草的挥发油成分[J].云南植物研究，1989，11（2）：209-214.

[4] 田景奎，邹忠梅，徐丽珍，等.细梗香草化学成分的研究[J].中国药学杂志，2006，41（3）：171-173.

[5] 田景奎，邹忠梅，徐丽珍，等.细梗香草中的两个新三萜皂苷[J].药学学报，2004，39（9）：722-725.

[6] 应弘梅.细梗香草总皂苷制备工艺及质量标准研究[D].杭州：浙江大学，2011.

[7] 吕武清，虞金宝，宋友昕，等.HPLC法测定满山香中山奈酚的含量[J].中草药，2004，35（4）：475-459.

[8] 唐琍萍，王  强，刘红宁，等.RP-HPLC法测定满山香中槲皮素和山奈素的含量[J].亚太传统医药，2008，4（1）：32-35.endprint