盐酸苄丝肼化学稳定性影响因素的研究

马桂芝　李文英　王娟　贺鑫韬　马文娜　滕亮

[摘要] 目的 考察影响盐酸苄丝肼稳定性的因素。 方法 建立用于测定盐酸苄丝肼含量的高效液相色谱法。在此基础上，考察溶剂pH、光线、氧气、温度、湿度对盐酸苄丝肼稳定性的影响。 结果 所建立的含量测定方法符合方法学要求。考察结果表明，溶剂的pH越大，盐酸苄丝肼越不稳定；光线对盐酸苄丝肼稳定性有影响，需遮光保存；在氧气的作用下，盐酸苄丝肼会发生氧化现象，加入相对于药物的质量分数25%的维生素C后，12 h内稳定性良好；温度与湿度的变化对盐酸苄丝肼化学稳定性有影响。 结论 通过控制外部条件，有望改善盐酸苄丝肼的化学稳定性。

[关键词] 盐酸苄丝肼；高效液相色谱法；化学稳定性；影响因素

[中图分类号] R971.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（b）-0004-05

帕金森病（Parkinson's disease，PD）又称为震颤麻痹，是一种中枢神经系统锥体外系功能障碍的慢性进行性疾病[1]。美国神经协会对各种抗PD药物进行评估，结果表明复方左旋多巴制剂（美多芭等）是所有PD药物治疗中最有效的药物[2-3]。但是该片剂使用方法繁琐，给药频率高，中老年患者的用药顺应性差，同时左旋多巴的吸收主要发生在胃和小肠近端（主要在十二指肠和空肠部位）[4]，普通左旋多巴片剂在胃内停留时间短，吸收量有限[5]，因此许多研究者都致力于复方左旋多巴缓释制剂的研究[6-9]。因此课题组结合前期研究结果[10-11]，尝试采用复合制剂技术将普通片研发成既可保证药物的疗效又能增加患者用药顺应性的微囊胃漂浮片[12-14]，以满足临床用药需求。该微囊胃漂浮片是由左旋多巴的微囊与盐酸苄丝肼的固体分散体作为中间体，与适宜辅料压制而成的片剂。

根据课题设计需要，制备的缓释制剂应满足12 h连续释放的要求，但是预试验结果表明盐酸苄丝肼在稀盐酸（9→1000 mL）中只能保证8 h内稳定。因此在进行苄丝固分体制备工艺筛选之前，先考察了盐酸苄丝肼稳定性及其影响因素，为后续盐酸苄丝肼固体分散体的处方筛选奠定实验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

数显恒速搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司，S312-60型）；高效液相色谱仪（日本岛津，LC-20A型）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司，DZF-6090型）；电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，BS110S型）。

1.2 试药

盐酸苄丝肼（湖北中和化工，批号：100511）；盐酸苄丝肼对照品（Sigma-Aldrich，批号：SL09032）；抗坏血酸（上海山浦化工有限公司，批号：20100504）；无水乙醇（安徽安特生物化学有限公司，批号：0808073601）；聚维酮（PVP，新疆华世丹药业，批号：060614）；盐酸（乌鲁木齐天岳化学试剂有限公司，批号：070917）；氢氧化钠（天津市福晨化学试剂厂，批号：20090909）；司盘-80（天津市福晨化学试剂厂，批号：060907）。液状石蜡（天津市富宇精细化工有限公司，批号：090703）；乙酸乙酯（天津市福晨化学试剂厂，批号：20100705）；邻苯二甲酸二乙酯（天津市福晨化学试剂厂，批号：20101110）。十二烷基硫酸钠（上海市四赫维化工有限公司，批号：20080415）。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，其中一级动力学方程以lgC对t进行直线回归获得。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 固体分散体中盐酸苄丝肼的含量测定方法

2.1.1 测定波长的确定 以稀盐酸（9→1000 mL）为介质配制0.1 mg/mL的盐酸苄丝肼对照品溶液。精密量取盐酸苄丝肼对照品溶液3 mL置于10 mL量瓶中，加稀盐酸（9→1000 mL）至刻度，摇匀，在200～600 nm波长范围内扫描，结果显示该溶液在220 nm波长处有最大吸收。

2.1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：三氟乙酸-甲醇-水=1∶20∶1000；流速：0.5 mL/min；检测波长：220 nm；进样量：20 μL；柱温：30℃。在上述条件下，盐酸苄丝肼达到基线分离，分离度大于1.5，以盐酸苄丝肼峰计算柱效，其理论塔板数（n）均在5000以上，取阴性对照溶液进样，结果表明，阴性对照在主药峰位置处没有相应峰出现。阳性对照品、供试品和阴性样品的高效液相色谱图分别见图1。

2.1.3 线性关系考察 精密称取盐酸苄丝肼标准品0.0125 g，用稀盐酸（9→1000 mL）定容至50 mL容量瓶制成储备液，分别精密吸取储备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL储备液置于10 mL量瓶中，稀盐酸（9→1000 mL）定容，摇匀。用高效液相色谱法于220 nm处测定各溶液的峰面积（A），以峰面积（A）对浓度（C）进行线性回归，盐酸苄丝肼回归方程为A = 1.139 89×10-5C+0.7215，r = 0.9996（n = 8），表明吸光度与浓度在2.448～58.752 μg/mL范围内线性关系良好。

2.1.4 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，重复进样6次，结果显示盐酸苄丝肼峰面积的RSD为1.29%。

2.1.5 稳定性试验 取样品溶液分别在0、2、4、6、8 h时进样测定，结果显示盐酸苄丝肼峰面积的RSD为1.04%。实验结果提示：该样品在8 h内稳定性良好。

2.1.6 重复性试验 取供试品溶液，重复进样6次，结果显示盐酸苄丝肼峰面积的RSD为1.05%。

2.1.7 加样回收率试验 分取已知含量供试品9份，分别精密加入高、中、低质量浓度对照品溶液各3份，按色谱条件，通过液相色谱仪测定峰面积，计算回收率，结果显示盐酸苄丝肼的平均回收率为99.66%，RSD为0.79%。见表1。

2.2 盐酸苄丝肼化学稳定性的影响因素

2.2.1 溶剂pH对稳定性的影响 用盐酸和氢氧化钠调制不同pH的水溶液作为溶剂溶解等量盐酸苄丝肼[15-16]，考察不同pH下盐酸苄丝肼含量随时间变化的变化，结果见表2。数据处理结果表明不同pH下盐酸苄丝肼含量变化规律可用一级动力学方程拟合。结果表明随着放置时间的延长，盐酸苄丝肼含量增均呈降低趋势。溶剂的pH越大，盐酸苄丝肼越不稳定，且由降解速率常数大可见pH对其化学稳定性的影响较为显著。而稀盐酸（9→1000 mL）的pH为1.2，可以提供盐酸苄丝肼较稳定的pH环境。

2.2.2 光线对稳定性的影响 用稀盐酸（9→1000 mL）溶解2份等量盐酸苄丝肼，1份在遮光条件下保存，2份在未遮光的条件下保存，平行实验3次，考察盐酸苄丝肼含量随时间的变化，结果见表3。统计学结果表明当放置时间达到12 h时两种条件下的盐酸苄丝肼含量差异有统计学意义（P < 0.05）。速率方程也表明光线对盐酸苄丝肼稳定有影响，随着放置时间的延长，盐酸苄丝肼含量均呈降低趋势，但是未遮光组盐酸苄丝肼含量降低的速度更快。以上结果提示遮光保存有利于增加盐酸苄丝肼的稳定性。

2.2.3 氧气对苄丝肼稳定性的影响 稀盐酸（9→1000 mL）溶解3份等量盐酸苄丝肼，其中1份空白，1份加入相对于药物的质量分数10%的抗氧剂抗坏血酸（维生素C），1份加入25%的维生素C，平行实验3次，考察盐酸苄丝肼含量随时间变化的变化，结果见表4。加入相对于药物质量分数10%维生素C，12 h后与不加抗氧剂的空白溶液相比，盐酸苄丝肼平均含量有提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。加25%维生素C，10、12 h后与不加抗氧剂的空白溶液相比，盐酸苄丝肼平均含量明显提高，差异有统计学意义（P < 0.05）。速率方程也表明氧气含量对盐酸苄丝肼稳定有影响，随着放置时间的延长，盐酸苄丝肼含量均呈降低趋势，但是加25%维生素C的盐酸苄丝肼含量降低的速度最慢。综合以上实验结果分析，盐酸苄丝肼会发生氧化现象，加入了25%抗氧剂后维生素C，12 h内稳定性良好。

2.2.4 温度对稳定性的影响 分别将等量盐酸苄丝肼原药粉放在60、40、25℃ 3个温度环境下遮光干燥保存10 d，于第5、10天取样溶于等量稀盐酸（9→1000 mL）中测其百分含量变化。见表5。结果显示温度的变化对盐酸苄丝肼有影响，温度越高稳定性越差。

2.2.5 湿度对稳定性的影响 将等量盐酸苄丝肼原药粉分别放在室温下，相对湿度为75%、60%、0%的环境下遮光保存10 d，于第5、10天取样溶于等量稀盐酸（9→1000 mL）测其百分含量。见表6。结果显示盐酸苄丝肼对湿度很敏感，在干燥环境下较稳定。

3 讨论

盐酸苄丝肼为脱羧酶抑制药，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮，其化学结构特点决定该化合物有可能对空气、光线、温度、湿度等敏感。因此本研究选择其标示百分含量为稳定性考察指标，建立了体外测定苄丝肼含量的高效液相色谱法，方法学考察结果表明该方法符合专属、准确、灵敏、精密的要求，可用于考察不同影响因素对苄丝肼化学稳定性的影响。

稳定性是药物的基本属性之一。药物的化学稳定性是指药物由于水解、氧化等化学降解反应，使药物含量（或效价）、色泽产生变化。采用合适的分析方法，考察不同条件（如温度、湿度、光线等）下药品主要质量指标随时间的变化情况，为药物制剂的处方设计提供依据，是药物制剂处方前期研究的重要内容。因此本研究在前期预试验的基础上结合制剂的设计要求（所设计的漂浮制剂要求在胃液中可持续漂浮12 h），考察了溶剂pH、光线、氧气、温度、湿度在不同时间点对盐酸苄丝肼稳定性的影响。

研究结果提示：①溶剂的pH越大，盐酸苄丝肼越不稳定，说明将盐酸苄丝肼制备成胃内漂浮片对其化学稳定性影响较小。②光线对盐酸苄丝肼稳定性有影响，提示在制备盐酸苄丝肼固体分散体的过程中需要避光，同时该漂浮片需遮光保存。③在氧气的作用下，盐酸苄丝肼会发生氧化现象，加入了25%抗氧剂维生素C后，12 h内稳定性良好，提示在固体分散体的处方优选过程中需要考虑引入抗氧剂以增加制剂的化学稳定性。④温度的变化对盐酸苄丝肼有一定影响。⑤湿度的变化会造成盐酸苄丝肼化学稳定性的显著改变，这可能是因为盐酸苄丝肼为水溶性化合物，具有较强的吸水性，吸水后液层中的盐酸苄丝肼极易发生化学改变。对各影响因素的影响程度进行初步分析，可认为环境湿度、溶液pH对盐酸苄丝肼的化学稳定性影响较为显著，其次为氧气的影响，影响较小的因素为光照与环境温度，因此在后续固体分散体处方设计时尤其要关注影响较为显著的因素。

[参考文献]

[1] Paul HG，Jason MM，Robert CH， et al. Parkinson's disease among American Indians and Alaska natives： a nationwide prevalence study [J]. Mov Disord，2012，27（11）：1456- 1459.

[2] Navailles S，Lagiere M，Contini A，et al. Multisite intracerebral microdialysis to study the mechanism of L-DOPA induced dopamine and serotonin release in the parkinsonian brain [J]. ACS Chem Neurosci，2013，4（5）：680-692.

[3] Lipski J，Nistico R，Berretta N，et al. L-DOPA： a scapegoat for accelerated neurodegeneration in Parkinson's disease [J]. Prog Neurobiol，2011，94（4）：389-407.

[4] Di Stefano A，Sozio P，Cerasa LS，et al. L-Dopa prodrugs： an overview of trends for improving Parkinson's disease treatment [J]. Curr Pharm Des，2011，17（32）：3482-3493.

[5] 徐娉，张璟.左旋多巴治疗帕金森病用药方法及疗效观察[J].中国实用内科杂志，2003，23（7）：443-444.

[6] 蔡云鹏，马柳青，张文君，等.苄丝肼微球的体外释放行为[J].现代生物医学进展，2012，12（11）：2158-2160.

[7] Goole F，Vanderbist K，Amighi. Development and evaluation of new multiple-unit levodopa sustained-release floating dosage forms [J]. International Journal of Pharmaceutics，2007，（334）：35-41.

[8] Goole PH，Deleuze F，Vanderbist，et al. New levodopa sustained-release floating minitablets coated with insoluble acrylic polymer [J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2008，（68）：310-318.

[9] Ren TT，Yang XX，Wu N，et al. Sustained-release formulation of levodopa methyl ester/benserazide for prolonged suppressing dyskinesia expression in 6-OHDA-leisoned rats [J]. Neuroscience Letters，2011，（502）：117-122.

[10] 马桂芝，滕亮，李文英，等.乳化-溶剂挥发法制备左旋多巴微囊[J].新疆医科大学学报，2014，37（1）：47-50.

[11] 李文英，马桂芝，滕亮.左旋多巴微囊制备工艺的研究[J].西北药学杂志，2011，26（6）：442-445.

[12] 赖珺，廖正根，杨明福，等.生物利用度的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志，2010，16（18）：226-229.

[13] 陆彬.药物新剂型与新技术[M].北京：人民卫生出版社，1998：222.

[14] 贺鑫韬，马桂芝，滕亮.左旋多巴微囊胃内漂浮片犬体内药动学研究[J].西北药学杂志，2014，29（2）：173-177.

[15] 黄敏，蒋伟哲，黄兴振，等.盐酸左旋多巴甲酯水溶液稳定性研究[J].中国药业，2008，17（8）：29-32.

[16] 陈汝红，郭毅，王熳，等.双苯氟嗪稳定性的影响因素研究[J].中国医药导报，2011，8（10）：37-39.

（收稿日期：2014-09-07 本文编辑：卫 轲）