LC—MS/MS法测定大鼠血浆中阿霉素的药物浓度及应用

张文萍　甘梦月　马妍妮　党宏万

[摘要] 目的 建立液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定大鼠血浆中阿霉素的血药浓度，并用于阿霉素载药纳米粒的体内药动学研究。 方法 色谱柱采用Shim-pack XR-ODS柱（2.0 mm×100 mm，2.2 μm），仪器采用API 4000三重四极杆串联质谱仪，采用多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）定量离子对为m/z544.2→m/z396.9（阿霉素）和m/z357.3→m/z133.8（吡格列酮，内标）；甲醇沉淀蛋白法处理样品。 结果 阿霉素在2.0～2000 μg/L范围内线性关系良好，定量下限为2.0 μg/L，血浆中的内源性物质不干扰阿霉素的测定；日内和日间精密度RSD均小于±15.0%；阿霉素低、中、高3个QC浓度的提取回收率分别为（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，基质效应分别为（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%。 结论 该方法适用于阿霉素纳米粒在大鼠体内的药物动力学研究。

[关键词] 液相色谱-串联质谱；阿霉素；药动学研究；含量测定

[中图分类号] R969.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（b）-0055-05

阿霉素主要通过嵌入DNA而抑制核酸的合成，产生细胞毒性作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用[1]。由于心脏毒性较大，在实体瘤内部渗透性差，临床应用受到极大的限制[2-3]。由于纳米给药系统具有靶向性、缓释性、降低药物毒性和提高药物稳定性等特点，阿霉素的纳米靶向传递是当前研究的热点[4-5]。由于纳米制剂给药量小，需要建立灵敏、高效的体内药物浓度测定方法进行药动学研究。目前，阿霉素的体内测定方法主要有HPLC-UV[6]、荧光光度法[7-8]、HPLC-FLU[9-12]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[13-15]等方法，以荧光检测方法为主，液相-质谱联用法报道较少。其中HPLC-UV、荧光光度法和HPLC-FLU检测灵敏度低，LC-MS/MS多采用液液萃取的提取方法，样品处理较复杂，且血浆用量大，分析时间较长，且用于阿霉素纳米制剂药动学研究的较少。本文旨在建立一种简便快速、专属性强的LC-MS/MS法测定大鼠血浆中阿霉素的血药浓度，并将其应用于阿霉素载药纳米粒的药物动力学研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

API 4000串联四极杆质谱仪（美国Applied Bio-systems公司），LC-30A高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司），Eppendorf AG5804R低温高速离心机（德国Eppendorf公司），XW-80A涡旋混合器（姜堰市康健医疗器具有限公司），梅特勒AE240电子天平（Mettler托利多仪器上海有限公司），Milli-Q ADVANTAGEA10纯水仪（Merck Millipore公司），DW-86L628医用低温箱（青岛海尔特种电器有限公司）。

1.2 试药

盐酸阿霉素（纯度>98.89%，上海宝曼生物科技有限公司，批号20120715），盐酸吡格列酮（含量质量分数>99.55%，济南中科一通化工有限公司，批号2011 0904），阿霉素载药纳米粒 （含量0.6 g/L，宁夏医科大学总医院临床药理研究室制备）。色谱甲醇、乙腈（美国Fisher公司）。

1.3 动物

6只SD大鼠，雄性，平均体重约为230 g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证号SCXK（宁）2011-0001。

2 方法与结果

2.1 溶液配制及样品处理

2.1.1 溶液配制 精密称取盐酸阿霉素10.7 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相当于阿霉素浓度为1.00 g/L的溶液。用甲醇水（1∶1）稀释浓度为2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L系列标准溶液，以及浓度分别为5、80、1600 μg/L的质量控制（QC）溶液，置于-4℃冰箱备用。

精密称取盐酸吡格列酮11.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后并定容，配制相当于吡格列酮浓度为1.00 g/L的溶液。取上述储备液用甲醇水（1∶1）稀释至浓度为15 μg/L的内标溶液，置于-4℃冰箱备用。

2.1.2 血浆样品处理 取大鼠血浆50 μL，置于1.5 mL EP管中，加入50 μL 15 μg/L吡格列酮溶液，50 μL甲醇水（1∶1），涡旋30 s，加入250 μL甲醇，涡旋2 min，4℃离心10 min（14 000 r/min），取上清液10 μL进样。

2.2 测定条件

2.2.1 色谱条件 色谱柱：（Shim-pack XR-ODS（2.0 mm×100 mm，2.2 μm）；保护柱：Shim-pack GVP-ODS（2.0 mm×5 mm，2.2 μm）；流动相：A相（0.1%冰醋酸），B相（甲醇），采用梯度洗脱，0～0.2 min，40%B相；0.2～0.8 min，80%B相；0.8～3.0 min，80%B相；3.0～3.5 min，40%B相，4.0 min结束，流速为0.2 mL/min；柱温40℃；进样量10 μL。

2.2.2 质谱条件 离子源：Turbo Spray；碰撞气6 psi；气帘气10 psi；雾化气60 psi；辅助加热气30 psi；离子喷雾电压4000 V；离子源温度350°C；去簇电压56 V；Q0电压10 V；碰撞能量15 V；碰撞池出口电位12 V。正离子模式检测；MRM监测。定量离子对为m/z 544.2→m/z 396.9（阿霉素）和m/z 357.3→m/z 133.8（吡格列酮，内标），二级扫描质谱图见图1。

2.3 分析方法确证

2.3.1 专属性 分别取6种不同来源的大鼠空白血浆各50 μL，置于1.5 mL EP管中，其中以50 μL甲醇水（1∶1）代替内标溶液，50 μL甲醇水（1∶1）代替阿霉素标准溶液体积，其余按照“2.1.2”项下方法操作，测定后为空白血浆样品色谱图（图2A）。

取空白大鼠血浆50 μL，置于1.5 mL EP管中，将质量浓度为2.0 μg/L的阿霉素标准溶液和内标溶液（15 μg/L）加入空白血浆中，其余按照“2.1.2”项下方法操作，测定后为含药血浆样品色谱图（图2B）。其中，阿霉素和吡格列酮的保留时间分别约为2.58 min和3.19 min。

取大鼠给药后4 h采集的血浆样品，按照“2.1.2”项下方法操作，测定后为实际血浆样品色谱图（图2C）。如图所示，大鼠血浆中的内源性物质对阿霉素及吡格列酮测定无干扰，说明本方法专属性良好。

2.3.2 标准曲线与定量范围 取6 份空白大鼠血浆各50 μL，分别加入内标溶液50 μL，再加入阿霉素系列标准溶液，制成阿霉素浓度为2、4、10、20、100、400、1000、2000 μg/L的含药血浆样品，按“2.1.2”项下处理后测定；以阿霉素浓度为横坐标，阿霉素与内标物的峰面积比值为纵坐标，得到典型回归方程为：A=0.00528C-0.00593，r=0.9976。结果表明，阿霉素在2.0～2000 μg/L浓度范围内线性关系良好，定量下限为2.0 μg/L，可以满足大鼠血浆中阿霉素浓度的测定。

2.3.3 精密度与准确度 取大鼠空白血浆50 μL，按照“2.3.2”项下方法制备浓度为2.0 μg/L的阿霉素定量下限样品6份，按血浆样品处理方法处理后测定，日内精密度RSD为13.4%，准确度为-2.3%。

取大鼠空白血浆50 μL，按照“2.3.2”项下方法制备阿霉素浓度分别为5、80、1600 μg/L的QC样品，每浓度平行制备6样本，连续测定3 d，计算日内、日间精密度与准确度，结果见表1。由表1可知本方法精密度与准确度良好。

2.3.4 提取回收率 提取样品的制备（EX QC）：取6种不同来源的空白大鼠血浆50 μL，按“2.3.2”项下方法配制阿霉素浓度为5、80、1600 μg/L的QC样品，每浓度平行制备6样本，进样分析，记录相应的色谱峰面积。

未经提取样品的制备（NEX QC）：同时另取6种不同来源的大鼠空白血浆各50 μL，加入甲醇溶液250 μL，涡旋2 min，离心10 min（14 000 r/min），吸取上清液，加入5、80、1600 μg/L的QC溶液50 μL，内标溶液50 μL，混匀，进样分析，每浓度平行制备6样本，记录相应的色谱峰面积。

提取回收率计算：以每一浓度EX样本测定所得的分析物峰面积除以NEX样本测定所得的分析物峰面积，同一来源血浆一对一求比值，计算对3个QC浓度的分析物于6个不同来源的血浆基质中的提取回收率，RSD应不大于15%；以EX样本测定所得的内标峰面积除以NEX样本测定所得的内标峰面积，同一QC浓度的同一来源血浆一对一求比值，计算对工作浓度的内标的提取回收率，RSD应不大于15%。

阿霉素低、中、高3个QC浓度的提取回收率分别为（92.1±5.9）%、（82.8±2.9）%和（80.1±9.7）%，内标提取回收率为（91.6±12.0）%，RSD均≤12.0%，结果可知提取回收率良好。

2.3.5 基质效应 含有基质样品的制备：同“2.3.4”项下未经提取样品的制备方法操作。

无基质样品的制备（溶液W样本）：取纯水50 μL代替空白血浆，分别加入50 μL IS溶液、50 μL阿霉素浓度为5、80、1600 μg/L的QC标准溶液，再加入250 μL甲醇，每浓度各6样本，涡流后测定，记录相应的色谱峰面积。

基质效应计算：以每一浓度NEX样本测定所得的分析物峰面积除以W样本测定所得的分析物平均峰面积，计算6个不同来源的血浆基质中内源性物质对3个QC浓度的分析物的基质效应，RSD应不大于15%；以NEX样本测定所得的内标峰面积除以W样本测定所得的内标平均峰面积，计算内源性物质对工作浓度的内标的基质效应，RSD应不大于15%。

阿霉素低、中、高3个QC浓度的基质效应分别为（91.1±2.4）%、（82.1±1.7）%和（81.2±2.5）%，内标基质效应为（109.0±10.0）%，结果符合规定[16]。

2.3.6 稳定性 按“2.3.2”项下方法分别配制阿霉素浓度为5、80和1600 μg/L的含药血浆样品，考察阿霉素血浆样品在室温放置12 h稳定性、样品处理后放置24 h稳定性、-70℃ 3次冻融稳定性以及-70℃长期放置30 d稳定性。结果如表2所示，阿霉素在以上条件下稳定性良好。

2.4 生物样品测定

2.4.1 给药方案及血浆样品采集 6只健康SD大鼠，雄性，平均体重约为230 g，分别尾静脉注射阿霉素载药纳米粒，给药剂量为5 mg/kg。给药后分别在0.087、0.167、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6、10、24、48、72 h眼眶取血0.5 mL，取血后立即移入经肝素处理的试管中，4℃离心10 min（14 000 r/min），分离血浆，于-70℃冰箱中冷冻，待分析。

2.4.2 血浆样品测定 血浆样品的处理按照“2.1.2”项下方法进行，根据当日标准曲线，计算各时间点血浆中阿霉素的浓度，同时测定浓度为5、80、1600 μg/L的QC样品。血药浓度-时间曲线如图3所示。

2.4.3 药物动力学参数计算 采用DAS 3.0药动学软件处理，非隔室模型法计算阿霉素载药纳米粒注射后的主要药动学参数。其中AUC0-t为（2585±273）μg·h/L，AUC0-∞为（2854±240）μg·h/L，ke为（0.03±0.01）/h，t1/2为（28.40±7.27）h，tmax为（0.08±0.00）h，V为（71.87±18.07）L/kg，血浆清除率为（1.76±0.15）L/（h·kg），Cmax为（3253±968）μg/L。

3 讨论

3.1 液相条件的考察

有机相为甲醇时，阿霉素的响应比用乙腈时高约1.5倍；水相为0.1%冰醋酸时，阿霉素的响应比0.1%甲酸高约1.2倍；采用梯度洗脱时，阿霉素和内标的峰形良好，无拖尾。最终确定以甲醇-0.1%冰醋酸作为水相，甲醇作为有机相，梯度洗脱。

3.2 测定方法的比较

文献中虽然已有LS-MS/MS法测定阿霉素体内浓度的报道[13-15]，但多采用氯仿-甲醇（4∶1）和乙酸乙酯进行液液萃取，样品处理较复杂，且血浆用量大，本研究只需要大鼠血浆50 μL，文献中分别使用200 μL和400 μL，是本研究的4倍和8倍。虽然定量下限最低可以达到1.0 μg/L，但血浆样品处理方法比较复杂，采用乙腈沉淀蛋白后，将上清液取出用氮气吹干，再用流动相复溶，灵敏度虽高，但制样过程时间较长；同时，阿霉素的出峰时间为4.9 min，约为本研究的2倍。本研究采用甲醇直接沉淀蛋白，处理方法简单，阿霉素在给药后2.58 min左右出峰，大大缩短了分析时间。

本研究建立的大鼠血浆中阿霉素浓度测定的LC-MS/MS法，样品处理方法简单、专属性强、分析时间快，能够满足阿霉素纳米粒在大鼠体内的药动学研究。

[参考文献]

[1] Siurala M，Bramante S，Vassilev L，et al. Oncolytic adenovirus and doxorubicin-based chemotherapy results in synergistic antitumor activity against soft-tissue sarcoma [J]. Int J Cancer，2014，Epub ahead of print.

[2] Vejpongsa P，Yeh ET. Prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity： challenges and opportunities [J]. J Am Coll Cardiol，2014，64（9）：938-945.

[3] Ta T，Bartolak-Suki E，Park EJ，et al. Localized delivery of doxorubicin in vivo from polymer-modified thermosensitive liposomes with MR-guided focused ultrasound-mediated heating [J]. J Control Release，2014，194C：71-81.

[4] Wang B，Feng D，Han L，et al. Combination of apolipoprotein A1-Modi Liposome-Doxorubicin with autophagy inhibitors overcame drug resistance in vitro [J]. J Pharm Sci，2014，Epub ahead of print.

[5] Deng H，Liu J，Zhao X，et al. PEG-b-PCL copolymer micelles with the ability of pH-controlled negative-to-positive charge reversal for intracellular delivery of doxorubicin [J]. Bioma cromolecules，2014，Epub ahead of print.

[6] 童珊珊，余江南，徐希明，等.反相高效液相色谱法测定阿霉素在小鼠血清中的含量[J].江苏大学学报：医学版，2002，12（6）：563-565.

[7] 闫继东，辛华，郑雅娟，等.应用荧光分光光度法测定血清及组织中阿霉素含量[J].中国实验诊断学，2007，11（5）：596-597.

[8] 马玉彦，陈晾，石于波，等.荧光分光光度法测定人血清中阿霉素含量的方法研究[J].实用肿瘤学杂志，1994，3：319-320.

[9] 张宏文，钱立新，王蔚青，等.反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆及膀胱中阿霉素的浓度[J].江苏药学与临床研究，2006，14（1）：4-5.

[10] 文旭，范健，缪玉山.大鼠血浆及组织中阿霉素含量测定方法（HPLC内标法）的建立[J].南京铁道医学院学报，2001，20（2）：77-79.

[11] 徐小薇，付强，李大魁，等.HPLC测定兔血浆及淋巴组织中的阿霉素[J].南京铁道医学院学报，1996，31（2）：97-99.

[12] 何素梅，魏树礼，吴传斌，等.反相高效液相色谱荧光检测法测定血浆或肝组织中阿霉素含量[J].药物分析杂志，1994，14（4）：8-11.

[13] 陈思明，金艺，乔明曦，等.大鼠血浆中阿霉素HPLC-MS/MS测定法及其在药动学中的应用[J].沈阳药科大学学报，2012，29（3）：199-202.

[14] 刘奕明，林爱华，邓时贵，等.液相色谱-串联质谱法测定兔血浆阿霉素浓度[J].药物分析杂志，2009，29（8）：1282-1286.

[15] 祝春来，张邦乐，宦梦蕾，等.液相色谱-串联质谱法同时测定大鼠血浆中阿霉素和塞来昔布[J].现代生物医学进展，2009，9（22）：4222-4225.

[16] Surenra B，Anthoy D. Key elements of bioanalytical method validation for small molecules [J]. The AAPS Journal，2007， 9（1）：E109-E114.

（收稿日期：2014-08-10 本文编辑：程 铭）