食物源降血压肽的制备与功能评价

李 慧，吕 莹，丁 轲，韩 涛

(农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室/北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206)

目前，高血压是一个全球性健康问题，据统计，我国现有高血压患者近2.5 亿。通过使用血管紧张素转化酶抑制剂 (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor，ACEI)可抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，使血管紧张素Ⅱ的生成和激肽的破坏均减少，可使血压下降，达到一定治疗高血压的效果［1］。ACEI 类药物是降血压药物中发展最快的一类，合成的降血压药物约有200多种，均需终身服用，且副作用大［2］。越来越多的专家和患者把目光投向食物中的营养物质，希望通过天然物质的摄入来辅助调节人体血压。源于食品的降血压肽具有降血压效果且不会对人体产生副作用，仅对高血压患者起降压作用，对正常人无降压作用。许多研究者从不同的动植物蛋白中分离提取出多种天然的ACE 抑制肽(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides，ACEIP)，开发天然降血压肽产品成为降血压药物的一个研究方向。

1 降血压肽研究进展概述

自1965年从蛇毒中发现ACEIP 以来，降血压肽的研究引起了广泛关注。日本最早从价廉的水产鱼蛋白质中开发出有效的ACEIP，如酶解鲣鱼蛋白制备降血压肽，并进行动物实验及临床实验，证明是有效的降压食品［1］。据日本1992年专利记载，降血压肽已从胰凝乳蛋白酶处理的小麦谷蛋白中分出，该肽(2g/kg)通过腹腔给予具有高血压的小鼠，3h 后，小鼠血压自200 mm-Hg 降至184mmHg。1995年Fujita［3］等通过酶解法从鸡蛋中发现第一个降血压肽Ovokinin，氨基酸序列为Phe-Arg-Ala-Asp-His-Pro-Phe-Leu。吴建平和丁霄霖［4］以大豆为原料，对降压肽制备、高活性ACEIP 的酶系筛选、及酶解条件的优化进行了研究。近年来，已对多种食物蛋白中降血压肽进行了研究，原料包括谷类、豆类、肉类、乳类及一些副产物中的废弃蛋白等。

降血压肽作为ACEI 在所有生物活性肽中研究得最为成熟，潜在应用价值最高。研究认为，ACEIP 的C 端是Pro 或芳香族氨基酸或N 端含有疏水氨基酸是维持高活性的共同特征［5］。现已从多种蛋白原料的酶解产物中分离鉴定了多种结构、序列及长度不一的ACE 抑制肽［6］。目前，降血压肽的研究热点为酶的筛选、肽的分离纯化等环节，人们对降血压肽的效与量较为重视，但只有能抵抗胃肠消化酶消化，或被胃肠消化酶、ACE 降解成更小片段的具有体内降压效果的ACEIP，是研究的重点［7］。本文就不同食物来源降血压肽的制备、分离纯化及功能评价等环节进行综述。

2 降血压肽的制备

目前，降血压肽制备方法主要有化学合成法、自溶法、DNA 重组技术、酶解法(直接酶解、微生物发酵)等。其中，化学合成法可制取任意需要的活性肽，但成本高、副反应物及残留物较多;自溶法由于原料范围较窄，使用受限;DNA 重组技术多用来合成长肽和蛋白质，ACE 抑制肽大部分为短肽，可通过基因重组、工程菌的发酵和高效表达加以实现［8］;酶解法具有高效性和专一性，可根据不同的原料选择合适的酶及酶解条件，对蛋白质营养价值破坏小、最为常用，前人对该方法的工艺做了很多研究，研究目的是要找到水解特定原料蛋白的最适酶及酶解过程的条件，如底物浓度、酶底比、最适温度和最适pH 等。

2.1 单酶水解法

用脱脂米糠提取类阿片拮抗肽后的残留蛋白作为试验原料，采用胰蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶、Flavourzyme、Protamex 和中性蛋白酶酶解米糠蛋白，底物浓度为1mg/mL，水解250 min，发现碱性蛋白酶水解物具明显ACE 抑制活性;不同水解度(DH)的酶解产物对ACE 抑制活性存在较大差异，DH 增加，酶解物的ACE 抑制活性增加;当DH 为15.4%时，ACE 抑制活性最高，继续增加DH，酶解物ACE 抑制活性反而下降［9］。

用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶分别酶解麦胚蛋白生产降血压肽，发现碱性蛋白酶在pH 9、50—55℃、加酶量24AU/kg 条件下，水解产物活性最高，ACE 抑制率88.46%［10］。用以上蛋白酶水解大豆蛋白，发现碱性蛋白酶制备的大豆肽ACE 抑制率最高，最优条件:55℃，pH 9.0，底物质量分数8%，酶添加量8 000U/g，5h［11］。利用碱性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、嗜热菌蛋白酶分别水解螺旋藻(Spirulina platensin)蛋白，发现Alcalase 水解产物具有较高ACE抑制率;调节pH 8.5，50℃，以底物浓度2% (w/w)，E/S 0.04% (v/v)加入Alcalase 酶解10h，经超滤膜过滤后得到具ACE 抑制活性的肽，IC50为0.23mg/mL (水解产物IC500.47mg/mL)［12］。

2.2 复合酶水解法

将胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶、复合蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶两两复合酶解麦胚蛋白生产降血压肽，活性最高组合为碱性蛋白酶加胃蛋白酶，ACE 抑制率88.32%［10］。

碱性蛋白酶和中性蛋白酶分步水解玉米蛋白分离液，调节pH 8.5，55℃，以E/S 1∶100 加碱性蛋白酶酶解3h，再以相同E/S 加中性蛋白酶，pH7.0，45℃酶解2h，经离心、膜过滤后得到玉米低聚肽，ACE 抑制IC50为1.020mg/mL［13］。利用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步酶解红小豆蛋白，酶解产物又在体外模拟胃肠体系中进行酶解，最终水解物的ACE 抑制IC5067.2μg/mL［14］。由碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解大西洋鲑鱼皮，调节pH 8.5，50℃，以E/S 1∶100 加碱性蛋白酶酶解3h，再以E/S 1∶50 加木瓜蛋白酶，pH7.0，60℃酶解2h，经离心、膜过滤得到鲑鱼皮胶原肽(SSCP)，ACE 抑制IC50为1.165mg/mL［15］。

2.3 微生物发酵法

微生物发酵法生产多肽不需要蛋白酶的提取过程，微生物在生长过程中可产生各种酶类，是由多种蛋白酶组成的复合酶系，包括细胞壁结合的蛋白酶，还有一系列细胞内肽酶，如肽链内切酶、氨基肽酶、二肽酶、三肽酶［8］。因而，菌种的选择对发酵法制备降血压肽有重要意义。

Nejati［16］等筛选出乳酸菌Lactococcus lactis DIBCA2发酵牛乳，用RP-HPLC 分离发酵乳中的肽，得到最高的ACE 抑制率IC505mg/mL。徐丽丹［17］从36 株耐酸耐胆盐的供试菌株中筛选出5 株活性菌株的发酵乳，具有较强ACE 抑制活性，其中DM9028 菌株发酵乳的ACE抑制率为80.69%，菌株DM9057 发酵乳对自发性高血压大鼠(SHR)有明显的降压效果，对正常SD 大鼠未观察到明显的降压作用［17］。

传统的发酵豆制品中含丰富的降血压肽，Nakahara等通过提高酱油酿造原料中蛋白含量，缩短发酵时间，选用富含分生孢子的发酵剂Tane koji 进行酿造，所得酿造酱油(FSS)总肽浓度比常规酱油提高2.7 倍，经SHR 及Dahl salt-sensitive rats 实验，均显示FSS 具有降血压活性，纯化后得到活性最高的肽Ala-Trp (IC5010μg/mL)［18］。

2.4 DNA 重组

近年开始将DNA 重组技术用于降血压肽的研究中，为降血压肽制备实现工业化打下基础。饶胜其［19］等通过基因工程技术得到重组降血压肽多聚体，经胃肠酶作用后的水解液具有很强的ACE 抑制活性，IC5035.2μg/mL。孙海燕［20］等对重组降血压肽的高效表达进行研究，将表达产物分离纯化，得到3 个较高纯度的降血压肽:Val-Leu-Pro-Val-Pro、Lys-Val-Leu-Pro-Val-Pro、Val-Leu-Pro-Val-Pro-Arg，IC50分别为1.8、4.6 和2.9μmol/L。

3 酶解物的分离纯化及其活性大小的评价

通过超滤、Sephadex G-15 对鲨鱼肉蛋白酶解液(IC500.4 mg/mL)进行分离，得到的活性组分用C18-10柱进一步分离，最后得到4 个ACE 抑制活性肽，LC/MS-MS 测定其序列分别为Cys-Phe、Glu-Tyr、Phe-Glu 和Met-Phe，其中前3 个肽首次从鲨鱼蛋白中提出，IC50分别为1.96、2.68、1.45μM［21］。

Doyen 等［22］在超滤膜的堆叠电渗析池中进行β-乳球蛋白的酶解及肽的分离，240min 后分别在阴离子和阳离子肽回收室检测到15 个阴离子肽和4 个阳离子肽;回收的15 个阴离子肽中有2 个降胆固醇肽，3 个降血压肽和1 个抗菌肽，其集中迁移率介于5.5%和81.7%;在4个阳离子肽中，序列为Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg 的肽之前被鉴定为lactokinin 并可发挥降压活性。该方法是第一次在电场下同时分离阴离子肽和阳离子肽。

经C18 柱对玉米低聚肽进行分离纯化，得到活性最高组分A，IC50为0.082mg/mL，经四级杆飞行时间质谱仪电喷雾离子联用(Q-TOF2/ESI)分析组分序列结构，发现Ala-Tyr 具有强ACE 抑制作用，IC50为0.037mg/mL［13］。C18 柱对鲑鱼皮胶原肽(1.0mg/mL SSCP ACE抑制率为44.12%，IC50为1.165mg/mL)进行分离纯化，得到11 个活性组分，组分5 和7 有较高ACE 抑制活性，分别为91.10%、80.51%;经Q-TOF2/ESI 分析，对其中二肽序列Ala-Pro 和Val-Arg 进行合成并测定ACE 抑制活性，IC50分别为0.060 和0.332mg/mL［15］。相同方法对乌骨鸡肌肽(IC50为2.86mg/mL)进行分离纯化，得到5 个活性组分，对活性较高组分3-5 进行测序，得29个肽，将其中11 个肽合成并测定ACE 抑制活性，其中Lys-Pro-Gly-Val、Asn-Met、Leu-His 呈现强ACE 抑制活性，Leu-Glu-Arg、Gly-Ala-Gly-Pro 有较强活性，IC50分别为45.62μM、253.07μM［15］。

利用凝胶过滤层析对螺旋藻(S.platensin)酶解产物(MW 0-3000D)进行分离，得到5 个吸收峰，其中组分IV 具有较强ACE 抑制率，IC50为0.091mg/mL，该组分经C18 进一步分离，得到有较强ACE 抑制活性的组分B，IC50为0.0039mg/mL，再经C18 分离仅出现单峰，其IC50为0.0021 mg/mL，氨基酸序列为Ile-Gln-Pro［12］。

采用Sephadex G-25 和RP-HPLC 对西班牙干火腿中水溶性肽提取物进行分离，通过nLC-MS/MS 得到73 个多肽序列，分子量集中在374-1610D，主要是5-14 氨基酸残基的肽，其中ACE 抑制活性最高的肽为Ala-Ala-Ala-Thr-Pro，IC50100μM，此肽经SHR 口服8h 后，收缩压下降25.65±4.50 mmHg［24］。

海蜇蛋白经胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解，2000D 超滤膜后，滤液IC50为1.28mg/mL，由SP-Sephadex C-25和Sephadex G-25 进一步分离，得到活性高的组分再用ODS 柱分离，最终得2 个ACE 抑制肽，其氨基酸序列确定为Gln-Pro-Gly-Pro-Thr 和Gly-Asp-Ile-Gly-Tyr，ACE抑制活性IC50分别80.67 μM 和32.56 μM，SHR 经口服后，血压明显下降［25］。

Alcalase 酶解轮虫(Brachionus rotundiformis)蛋白所得酶解液IC50为0.63 mg/mL，经Sephadex G-25 分离，再由ODS 得到纯化的ACE 抑制肽，IC50为9.64 μM，氨基酸组成Asp-Asp-Thr-Gly-His-Asp-Phe-Glu-Asp-Thr-Gly-Glu-Ala-Met，分子量1538D［26］。

可以看出，具有ACE 抑制活性的肽结构中，N 端疏水氨基酸、C 端Pro 和C 端芳香族氨基酸出现频率较高，依次为53.3%、26.6%、33.3%。另外，分子量在500D 以下的小肽居多。

4 降血压肽的功能评价

目前食源性降血压肽的评价方法主要有体外和体内实验。前者主要是测定多肽对ACE 的抑制能力，检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、荧光法等。体内实验有动物实验和人体临床实验。

4.1 体外实验

体外实验使用较广泛的是1971年Cushman 和Cheung 建立的紫外分光光度法，根据ACE 在体内特异性切下肽C 末端的2 个氨基酸的作用原理，选择含有马尿酸(Hip)的三肽作为底物，通过测定加入抑制剂前后生成马尿酸的紫外吸收差别可得抑制活性的大小，但该方法对实验操作要求高，易产生误差。第2 种是色谱法，通过测定ACE 抑制剂加入前后，马尿酸出峰面积的变化来计算抑制率，该方法准确度高，检测时间较短，适合于降血压肽的快速筛选［27］。还可采用微胶束毛细管电泳定量分析马尿酸，缩短分析时间和提高精确度［28］。第3 种是可见分光光度法，将底物由含有马尿酸的三肽换为蓝色的Phe-Ala-Pro-Gly-Gly，在ACE 作用后，通过光吸收减弱的程度来评价ACE 抑制肽的活性，此法较前两种更加方便实用［29］。

此外，用酶偶联法测定ACE 抑制肽活性，是以Hip-Gly-Gly 为底物，生成Hip 和双甘肽，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，催化生成3-羧基-4-硝基苯胺，于410nm 检测光吸收，操作简便，重复性好［10］。

4.2 动物实验

许多研究表明，食物源降血压肽ACE 抑制活性结果和动物模型降血压的结果并不完全吻合［2］，因而这类肽的降血压功能需要在高血压动物模型身上进行评价与确认。每日给40 只SHR (随机分成5 组)口服0.45、1.35、4.05g/kg 的玉米低聚肽，连续8w，以蒸馏水和10mg/kg 卡托普利分别作阴性和阳性对照，测量收缩压(SBP)，与阴性对照相比，0.45g/kg 剂量组大鼠从第6w，SBP 明显降低，约40mmHg;1.35g/kg 剂量组在8w后SBP 降低了35mmHg;4.05g/kg 剂量组SBP 略有降低，但变化不明显，其中阳性对照第4w 显著降低了45mmHg［13］。

以10 mg/kg 给SHR 喂螺旋藻肽Ile-Gln-Pro，以相同浓度卡托普利作阳性对照，测SBP 和舒张压(DBP)，4、6、8h SHR 的SBP 和DBP 均有明显降低，阳性对照在2、4、6、8h 的值均低于实验组［12］。Lee［30］等以10 mg/kg·bw 给SHR 口服金枪鱼组织蛋白水解肽，以卡托普利作阳性对照，9h 内SHR 的收缩压均呈现降低趋势，6h 时实验组和对照组收缩压均下降最大，分别下降21、26mmHg。

4.3 人体临床实验

临床试验是检验ACEIP 效果的最终方法，但降血压肽或含降血压肽的食品在人体中的功能研究十分缺少，目前相关研究结果还未出现负面的报道。Sekiya［31］等以酪蛋白的胰蛋白酶水解液进行人体试验，给4 个血压正常自愿受试者20g 和40g 的单剂量上述水解产物，均未出现血压和脉搏率的改变;给4 个轻度高血压受试者10g 和20g 的单剂量上述产物发现血压有降低趋势，脉搏率未有改变;另外一组18 个轻度高血压受试者每日摄入20g 上述产物4w 后，血压降低了4.6mmHg/6.6mmHg，脉搏率未改变［31］。用鲣鱼水解物作临床交叉实验，61 位自愿临界高血压和轻度高血压受试者中，第1 组30人，按125 mg/kg·bw 服用水解物，第2 组31人，服用安慰剂;5w 后，服用水解物的受试者收缩压下降了11.7 mmHg，舒张压下降了6.9 mmHg;随后两组交换服用物，交叉后服用水解物的受试者收缩压下降了9.4 mmHg，舒张压下降了4.6 mmHg，所有受试者体质指数没有明显的变化，表明水解物对人体没有副作用［32］。

5 结论

食物源降血压肽具有良好的降血压效果和较高的安全性，在功能性食品及药品的开发方面有广泛的应用前景。降血压肽的研究重点主要在以下方面有待攻关:降血压肽的制备中酶的筛选、复合及条件优化需进一步探索;低成本高效的工业化分离纯化方法还有待进一步开发;ACEIP 的动物实验和临床实验方面的研究还需加强，以确定其体内降血压效果;另外，明确较高降血压活性肽的氨基酸序列，为降血压肽的结构和功效之间的关系提供理论参考。

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