水牛乳中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选与鉴定

谢芳，曾庆坤*，杨承剑，唐艳，农皓如，李玲，冯玲

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001）

水牛乳中高产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选与鉴定

谢芳，曾庆坤*，杨承剑，唐艳，农皓如，李玲，冯玲

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西南宁530001）

从新鲜水牛乳中筛选出三株高产γ-氨基丁酸（GABA）的菌株G-24、G-25、G-29。通过菌株形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定这三株菌均为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis），将其分别接种于10 mL含0.01 g/mL谷氨酸的MRS液体培养基中，37℃培养72 h，其产γ-氨基丁酸含量均可达60 mg/100 mL以上。

γ-氨基丁酸；乳酸菌；筛选；鉴定

从动、植物以及微生物等自然环境中分离、筛选生物活性物质已经成为目前功能性食品研究开发的热点。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于自然界中，包括微生物、植物和动物[1]。它是脊椎动物中枢神经系统中的一种抑制性神经递质，具有神经传递、降低血压、利尿以及安神等重要生理功能[2]。由于GABA有着许多重要的生理功能，而人体内γ-氨基丁酸的合成主要有两条途径，一是通过人体自身合成，但是随着年龄的增长或疾病等原因，自身合成γ-氨基丁酸的能力会下降，因而不能满足自身的需求；另一途径是从食物中获得，但是天然食物中γ-氨基丁酸的含量很低。因此，微生物合成γ-氨基丁酸在医药与食品领域具有广泛应用前景[3]。

谷氨酸脱羧酶（EC 4.1.1.15）（glutamate decarboxylase，GAD）催化不可逆的α-脱羧反应使L-谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA），是生物催化谷氨酸脱羧生成GABA的限速酶[4]。谷氨酸脱羧酶广泛存在于真核生物和原核生物中，一些报道表明，乳酸菌中也存在谷氨酸脱羧酶[5-6]。目前乳酸菌大量被用于各种发酵食品，尤其是功能性乳制品当中。因此，筛选具有合成GABA活性的乳酸菌对于开发富含GABA的乳制品具有非常重要的意义。本研究拟从新鲜水牛乳中分离筛选具有合成GABA能力的乳酸菌并对其生理生化特性进行研究，这将为后续开发富含GABA的功能性水牛乳制品提供理论依据和基础条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茚三酮试剂：三门峡文泰化工有限公司；细菌总DNA提取试剂盒：德国Qiagen公司；谷氨酸脱羧酶基因扩增引物：生工生物工程（上海）股份有限公司；API 50 CHL菌种鉴定试剂条、API、50 CHL培养基、API试剂盒：法国梅里埃公司；L-谷氨酸钠：美国Biosharp公司；其他试剂为国产分析纯。

乳酸菌分离培养基为MRS固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉粉8 g，酵母粉4 g，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.04 g，琼脂14 g，吐温-80 1 g，20 g/L CaCO3；菌种活化培养基为体积分数10%的脱脂水牛乳；种子培养基为MRS肉汤液体培养基：酪蛋白酶消化物10 g，肉膏粉10 g，酵母膏粉4 g，柠檬酸三铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，磷酸氢二钾2.0 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1.08 g；发酵培养基为含不同质量浓度L-谷氨酸的MRS肉汤液体培养基。

1.2 仪器与设备

日立L-8800全自动氨基酸分析仪：日本日立有限公司；5804R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；LNG-T88台式快速冷冻离心机：上海赵迪生物科技有限公司；HM-LNG-T83浓缩干燥器：太仓市华美生化仪器厂；尼康ECLIPSE 50i正置生物显微镜：Nikon日本公司；BIOME TRA梯度PCR仪：德国BIOMETRA公司；SPX-150生化培养箱：北京科伟永兴仪器；DYY-11B型三恒多用电泳仪：北京市六一仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 水牛乳中乳酸菌菌株分离培养及纯化

将新鲜水牛乳进行梯度稀释后涂布于含20 g/L CaCO3的MRS平板上，于37℃培养24 h。挑取肉眼可见、生长较快、单个有溶钙圈的菌落分离并纯化，根据菌落特征进行初步归类，将革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株作为进一步筛选的乳酸菌待选菌株，并将其编号后于4℃保存备用。

1.3.2 产GABA菌株的筛选

将保存的待选菌种，取200 μL菌液转接到新的MRS固体平板上于37℃条件下培养48 h，再将单菌挑两环接到MRS液体培养基中37℃培养16 h，用作发酵种子，将分离到的菌株菌液分别取1 mL到5支有9 mL MRS液体培养基的试管中，摇匀，置于37℃培养箱活化24 h后，3支置于4℃冰箱保存备用，另2支用20%甘油管置于-20℃冰冻保存。

1.3.3 菌株鉴定

（1）菌落形态鉴定及生理生化试验鉴定

形态观察及生理生化特征：将分离纯化后的菌液取1 mL涂MRS平板，37℃培养48 h后，观察、记录菌落颜色、大小、边缘生长情况。取少量菌液经革兰氏染色后，用显微镜于100倍油镜观察并拍照。用划线法将菌株接种于MRS固体培养基上48 h，观察菌株的最佳生长温度（10℃、40℃、45℃）、耐酸碱性（37℃条件下pH 4.5及pH 9.6）及耐盐性（37℃条件下4 g/100 mL及6.5 g/100 mL NaCl）。利用葡萄糖产气实验、吲哚实验，过氧化氢接触酶实验，明胶液化实验进行生理生化鉴定[9-10]。

菌株的API试剂条鉴定：取适量活化后的菌液接种到API 50 CHL液体培养基中，摇匀，滴入API菌种鉴定试剂条中，封口，35℃条件下培养，记录24 h、48 h的颜色变化，按API LAB PlusV5.0软件鉴定。

（2）16S rDNA基因序列分析

采用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取DNA，以纯化后的DNA为模板，正向引物为5'-CCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCG-3'，反向引物为5'-TCATATTGACCGGTATAAGTGATGCCC-3'，以PCR技术检测乳酸菌中的谷氨酸脱羧酶基因[7]。

PCR反应体系（总体积50 μL）：10×PCR缓冲液5 μL；正、反向引物均为10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因组DNA 1.0 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；双蒸水34.5 μL。PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性45 s，55℃退火55 s，72℃延伸2 min，共进行34个循环；再72℃延伸10 min。

1.3.4 样品进样前处理

将PCR结果呈阳性的菌株接种于10 mL含0.01 g/mL的谷氨酸的MRS液体培养基中，37℃培养72 h，培养液经6 000×g，20 min离心，将所得上清液加入等体积的三氯乙酸振摇5 min后移入50 mL容量瓶中，用pH 2.0的柠檬酸缓冲液稀释至刻度，离心20 min除蛋白，经0.22 μm滤膜过滤后，进行γ-氨基丁酸定量分析[8]。

1.3.5 γ-氨基丁酸定量分析方法

用日立835-50氨基酸自动分析仪进行定量分析，具体程序及仪器工作条件为：分离柱：4.6mm×60mm；粒度3μm，柱填料：日立专用离子交换树脂：日立2619#，柱温50℃；反应温度135℃；光度计波长570 nm；泵压：泵1为7.8～9.8 MPa，泵2为1.5～2.0 MPa；流动相：采用不同pH值的柠檬酸盐缓冲液梯度淋洗分离，流速0.225mL/min；微孔滤膜。衍生剂为茚三酮试剂；运行时间55 min；手动进样，进样量：20 μL。将前处理后的样品用微孔滤膜过滤，上机分析[9-10]。

1.3.6 进化树构建及分析

将谷氨酸脱羧酶16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行Blast分析，选择同源性较高及已报道产GAD的细菌16S rDNA核苷酸序列，利用clustalx2.0进行多重比对，然后再利用MEGA4.0软件采用Neighbour-Joining方法构建系统发育树及分析。

2 结果与分析

2.1 产GABA菌株的分离、筛选

本试验共获得100个单菌，以各单菌的DNA为模板，利用PCR技术检测各单菌中的谷氨酸脱羧酶基因，结果显示有12株菌的DNA中能够扩增出谷氨酸脱羧酶基因片段，片段长度约为520 bp，结果见图1（仅对菌株中DNA扩增出氨酸脱羧酶基因片段明显的G24、G25、G29进行显示）。

对PCR结果呈阳性的12个菌株进行GABA定量分析，结果显示均有γ-氨基丁酸产生，其中产量最高的3个菌株结果如表1所示。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 菌落形态及菌体形态

最终所筛选的3株菌株的镜检观察结果以及平板菌落见图2。由图2可知，3株菌的菌落呈圆形，中央隆起，表面光滑湿润，边缘整齐，乳白色。经革兰氏染色为阳性，在形态上以单个或成对短杆状菌形式出现。

2.2.2 生理生化实验

参照文献[11-12]对菌株分离出的三株菌进行生理生化实验，结果见表2和表3。从表2和表3可看出，G-24、G-25和G-29的各项检测特征均符合文献中关于乳酸乳球菌[11]的描述，初步判定这三株菌株均为乳酸乳球菌。

2.2.3 序列比对及系统发育分析

谷氨酸脱羧酶基因片段大小为520 bp，以Clostridium baratii作为外群，将菌株G24、G25、G29的16S rDNA核苷酸序列分别与GenBank数据库中报道的16S rDNA核苷酸序列进行比对。结果显示，这三株菌株的16S rDNA核苷酸序列与数据库报道的Lactococcus lactissubsp.lactis菌株的16S rDNA核苷酸序列的同源性达到97%以上。选择已报道产GAD的细菌16S rDNA核苷酸序列构建系统发育树，结果如图3。

由图3可知，菌株G24、G25、G29与Lactococcus lactis subsp.lactis位于同一个簇，且同源性达99%，因此鉴定该菌株为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactissubsp.lac-tis，其他产GAD细菌的发育关系相对较远。

3 结论

本试验利用平板划线、PCR法[13]以及氨基酸分析仪筛选[14]得到了12株产γ-氨基丁酸的菌株并其对γ-氨基丁酸产量进行了定量分析[15]。该试验从生鲜水牛乳样品中分离筛选了3株高产GABA的乳酸菌菌株G24、G25、G29，根据这三株菌的形态特征、生理生化特征、16S rDNA序列比对分析和系统发育分析，这三株菌鉴定为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.lactis），其产γ-氨基丁酸含量均可达60 mg/100 mL以上。此类菌株为公认安全的食品级微生物，因其源于水牛乳中，有较强的GABA富集能力，在后续的研究中，有望通过培养基及培养条件优化等措施，其产量还可以进一步提高，并应用于水牛功能性乳制品的开发利用中，为广西特有的原生态水牛乳制品的深度开发奠定基础。

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XIE Fang,ZENG Qingkun*,YANG Chengjian,TANG Yan,NONG Haoru,LI Ling,FENG Ling
(Guangxi Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China)

Three strains G24,G25,G29 with highγ-aminobutyric acid(γ-GABA)-producing ability were isolated from buffalo fresh milk.Based on strain morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analysis,the three strains were identified asLactococcus lactissubsp.lactis.Theγ-aminobutyric acid production in the MRS medium with 0.01 g/ml glutamate 10 ml was up to 60 mg/100 ml after cultivation at 37℃for 72 h.

γ-aminobutyric acid;lactic acid bacteria;screening;isolation

Q939

A

0254-5071（2015）04-0102-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.023

2015-03-09

广西水牛研究所基本科研业务费项目（水牛基1301007）

谢芳（1980-），女，研究实习员，本科，研究方向为乳品加工。

*通讯作者：曾庆坤（1968-），男，研究员，硕士，研究方向为乳品科学与技术。