一株产β-葡萄糖苷酶烟曲霉菌株的鉴定及其产酶特性

刘德海，马 焕，解复红，权淑静，贾 彬，王红云，陈国参

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

一株产β-葡萄糖苷酶烟曲霉菌株的鉴定及其产酶特性

刘德海1，马 焕2，解复红2，权淑静2，贾 彬2，王红云1，陈国参1

（1.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南郑州450008；2.河南省工业酶工程技术研究中心，河南郑州450008）

从酿造大曲中分离筛选出一株产β-葡萄糖苷酶真菌菌株L1，根据对该菌株形态学观察和分子生物学18S rDNA分析，将其鉴定为烟曲霉(Aspergillus fumigates)，并对其所产β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了研究。结果表明，该酶的最适反应温度为50℃，热稳定性较好，在50℃保温120 min仍能保持79.6%酶活性；最适反应pH值为4.0，在pH值3.0～5.0酶活性稳定。

烟曲霉；β-葡萄糖苷酶；分离鉴定；酶学性质

β-葡萄糖苷酶是纤维素酶的成分之一，又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶，它能够作用于纤维二糖或纤维寡糖，使其水解为葡萄糖分子[1]。木质纤维素原料是自然界最丰富的可再生资源，也是主要的农业废弃物，β-葡萄糖苷酶在木质纤维素降解中起到关键作用，但其含量少、活力低，成为木质纤维素降解的瓶颈[2]。烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种自然界普遍存在的通过空气传播的的腐生真菌，能够引起食品腐败，但是烟曲霉能够分泌产生多种有用的酶类，能够产生几丁质酶、植酸酶[3]、壳聚糖酶[4]、纤维素酶[5]、淀粉酶[6]等，在酶工程领域有诸多应用，烟曲霉功能基因较多，烟曲霉包括一些编码酶类的基因、几丁质合成酶的基因、植酸酶合成基因等，梁东春等[7]根据GenBank中发布的烟曲霉菌壳聚糖酶（EC3.2.1.132）基因序列人工合成8条DNA长链及4条引物链，并成功在大肠杆菌中表达，所得重组壳聚糖酶具有降解壳聚糖的生物活性，王颖等[8]从烟曲霉中克隆114 kb的cDNA片段，编码一个氨基酸蛋白，序列分析表明该蛋白与其它真菌来源的几丁质酶同源；王严等[9]以自行筛选的烟曲霉WY-1为出发菌株，通过PCR方法克隆其植酸酶基因，并构建了含有植物信号肽序列的植酸酶基因植物表达载体。

本研究从酿造酒曲中分离筛选出一株产β-葡萄糖苷酶菌株L1，通过生物形态学观察及分子生物学18S rDNA分析，鉴定该菌株为曲霉属（Aspergillus）烟曲霉（Aspergillus fumigatus），并对其产β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了研究，以期为构建β-葡萄糖苷酶工程菌株及高效表达打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品采集

酿造砖曲：河南省王勿桥醋业有限公司。

1.1.2 培养基[10]

菌种保藏培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL；

菌种筛选分离培养基：（NH4）2SO44.0 g，NaCl 2.0 g，CaCO34.0 g，KH2PO41.0 g，纤维二糖5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，加入适量链霉素；

菌种筛选透明圈培养基：羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）2.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O0.5 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0，链霉素适量；

液体摇瓶发酵产酶培养基：麸皮2 g，（NH4）2SO40.4 g，KH2PO40.3 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，CaCl20.05 g，蒸馏水100 mL。

1.1.3 主要试剂

TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）：宝生物工程大连有限公司；琼脂糖：法国Biowest公司；MarkerⅢ：上海莱枫生物科技有限公司；对硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）：天津科密欧公司；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenylβ-D-glu copyranoside，p-NPG）、羧甲基纤维素钠：美国Sigma公司；纤维二糖：美国Amresco公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；DRP-9052型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；PHSJ-3F酸度计：瑞士Mettle Toledo公司；YP2102电子天平：上海光正医疗仪器有限公司、T-Gradient Thermoblock PCR扩增仪：德国Biometra公司；DYY-6C电泳仪：北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 筛选方法[11-12]

无菌操作条件下，取酿造砖曲1.0 g，置于盛有99 mL无菌蒸馏水三角瓶中，100 r/min往复振荡15 min，制成10-2菌液，将10-2菌液稀释成10-3、10-4、10-5、10-6稀释度菌液，按常规方法涂布分离培养，分别接入菌种筛选分离培养基平板上，挑取长出的单菌落，转接入PDA培养基试管斜面，观察得到的单菌落形态及外观，选择疑似烟曲霉菌株，接入菌种筛选透明圈培养基平板上，采用透明圈法对菌株进行第二次筛选，观察有无透明圈及透明圈大小，挑取能够在纤维二糖固体分离培养基平板上生长，且在菌种筛选透明圈培养基平板上有明显透明圈的的菌种，转接入PDA培养基试管斜面进行保藏。

1.3.2 液体摇瓶发酵产酶试验

液体摇瓶发酵产酶培养基进行产酶试验，250 mL三角瓶，液体发酵产酶培养基100 mL，每三角瓶接种试管斜面菌种2～3环，培养条件为30℃，转速180 r/min的摇瓶培养3 d后，进行β-葡萄糖苷酶酶活力检测分析。

1.3.3 粗酶液的提取

发酵液经四层纱布过滤，10000r/min离心分离10min，上清液即为粗酶液，置4℃冰箱保存备用。

1.3.4 酶活力的测定

采用对硝基苯酚法测定酶活[13]：取0.1 mL的待测酶液加入到5 mmol/L p-NPG溶液0.2 mL和pH值为5.0的醋酸缓冲液0.7 mL，于45℃恒温反应30 min后，立即加入0.5 mol/L Na2CO3溶液2.0 mL终止反应，再加入9.0 mL蒸馏水，于波长400 nm处测定吸光度值。

β-葡萄糖苷酶酶活力定义：在上述反应条件下，以1min内催化生成1 μmol p-NP所需的酶量定义为一个酶活力单位（U/mL）。

相对酶活测定：检测粗酶液的酶活力，以测得的酶活性最大值作为100%，其他的酶活为实际酶活除以最大酶活的百分数。其计算公式如下：

1.3.5 菌种的鉴定

菌种的形态生物学鉴定根据文献[14]，分子生物学鉴定根据文献[15]的方法对分离的菌种进行鉴定。

真菌DNA的提取按照试剂盒说明书进行得到基因。

采用真菌18SrDNA基因测序通用引物，上游引物ITS1：5′-TCCG TAGG TGAA CCTG CGG-3′和下游引物ITS4：5′-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3′。

PCR反应体系（50 μL）：dd H2O 37.0 μL；10×Buffer 5.0μL；dNTP2μL；上游引物2μL；下游引物2μL；TaqDNA聚合酶0.6 μL；真菌模板基因组DNA 1 μL。

PCR扩增条件：94℃预复性4 min，94℃变性30 s，56℃复性30 s，72℃延伸60 s，30个循环，72℃延伸10 min。

PCR反应产物经1%琼脂糖（Biowest）凝胶检测后送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析，测序结果序列，登陆NCBI上提交Genbank数据库进行BLAST同源性序列比对分析。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶酶学性质

最适反应温度：将底物p-NPG溶液分别在不同水浴温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下保温5 min，再加入经适当稀释0.1 mL的待测酶液，在不同温度下与底物进行酶促反应，在pH值为5.0的醋酸缓冲液条件下按照β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法测定其酶活力，以不加酶的溶液作为对照。以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，确定β-葡萄糖苷酶最适反应温度。

最适作用pH：配制不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸缓冲液，将适当稀释的酶液与底物p-NPG在相同温度45℃，不同pH缓冲液下酶促反应，按照β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法测定其酶活力，以不加酶的溶液作为对照。以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，确定β-葡萄糖苷酶最适作用pH。

热稳定性：将适当稀释的粗酶液分别在50℃水浴条件下保温0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min，立即冰浴冷却后取样，按照β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法测定其酶活力，以不加酶的溶液作为对照。以温度为横坐标，保温处理后酶液残余相对酶活力为纵坐标作图，考察温度对酶活力的影响。

pH稳定性：分别用不同pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0醋酸缓冲液配制酶液，在45℃保温30 min，按照β-葡萄糖苷酶酶活力测定方法测定其酶活力，以不加酶的溶液作为对照。以pH值为横坐标，相对酶活力为纵坐标作图，考察pH值对酶活力的影响。

2 结果与分析

2.1 产β-葡萄糖苷酶菌种的筛选

涂布平板法分离纯化：以纤维二糖为唯一碳源，按常规方法采用菌种筛选分离培养基平板涂布分离培养，通过对酿造大曲中分离β-葡萄糖苷酶产生菌的纯化培养，共分离得到15株菌株，根据文献[14]魏景超《真菌鉴定手册》观察得到的单菌落形态及外观，选择出疑似烟曲霉菌株3株，分别接入筛选透明圈培养基平板上进行二次筛选和液体发酵产酶试验，其结果见表1。由表1可知，L1菌株透明圈直径与菌落直径之比（H/C值）较大，产β-葡萄糖苷酶达到0.65U/mL，所测酶活力较高。故选择L1菌株进行分子生物学鉴定。

2.2 菌种的鉴定

2.2.1 菌株L1的形态特征

菌株L1在PDA培养基上培养3d后，其菌落特征见图1。

由图1可知，菌落中心稍凸起，初形成白色、圆形，绒毛状菌落，菌落反面浅黄绿色，显微观察可见，菌丝有隔膜，分生孢子梗光滑不分支，呈深浅不同的绿色，分生孢子穗圆筒形带绿色，分生孢子串生于小梗上，分生孢子球形或近球形，粗糙，绿色，顶囊膨大，分布在有隔扳的纵横交错的气生菌丝上。根据以上特征，对照魏景超《真菌鉴定手册》及相关文献报道，初步将L1菌株鉴定为真菌门（Fungi），半知菌类（Fungi imperfecti），丛梗孢目（Moniliales），丛梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉属（Aspergillus），烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.2.2 菌株L1的分子生物学鉴定

以提取的L1菌株DNA作为模板，采用引物ITS1：5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTAT TGAT ATGC-3′进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。

从图2可以看出，经PCR扩增后，根据与上海莱枫生物科技有限公司MarkerⅢ对照，得到了一个近600 bp大小的DNA片段。经测序后，得到完整的18S rDNA的基因序列，其测序序列片段长度为573 bp，具体序列见图3，将测序结果基因序列提交到GenBank核酸序列数据库中与已有的相关同源序列BLAST比对分析，结果表明，L1菌株18S rDNA基因序列与GenBank中已有的烟曲霉菌（Aspergillusfumigatus）相似性在99%，亲缘关系最近，其相似性、同源性分析见表2，并在18S rDNA基因序列同源性基础上构建系统发育树，见图4，结合形态学观察，表明菌株L1为曲霉属（Aspergillus），烟曲霉（Aspergillus fumigatus）。

2.3 菌株L1产β-葡萄糖苷酶酶学性质

2.3.1 最适反应温度

将菌株L1产β-葡萄糖苷酶在不同温度下（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）与底物反应，考察温度对酶活的影响，结果如图5。由图5可知，菌株L1产β-葡萄糖苷酶酶促反应的最适温度为50℃。

2.3.2 最适反应pH值

将菌株L1产β-葡萄糖苷酶在相同温度45℃，不同pH值条件下（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）与底物反应，考察pH值对酶活的影响，结果见图6。由图6可知，β-葡萄糖苷酶酶促反应的最适pH值为4.0。

2.3.3 酶的热稳定性

将菌株L1产β-葡萄糖苷酶在最适反应温度（50℃）条件下，保温不同时间0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min之后，考察酶的热稳定性，结果如图7。由图7可知，50℃条件下，β-葡萄糖苷酶在保温120 min时酶活性为79.6%，说明该酶有较好的热稳定性。

2.3.4 pH稳定性

将菌株L1产β-葡萄糖苷酶适当稀释的酶液分别在pH值1.0～7.0条件下保温处理30 min之后，考察酶的pH稳定性，结果如图8。从图8可以看出，β-葡萄糖苷酶的酶活性在pH值3.0～5.0之间稳定。

3 结论

马旭光等[16]对航天诱变菌株黑曲霉菌株产β-葡萄糖苷酶酶学特性进行了研究：该酶最适温度为55℃，55℃保温2 h酶活力保持95%以上；最适反应pH值为5.5，pH在3.0～6.0时酶活力稳定性良好。覃拥灵等[17]对产β-葡萄糖苷酶野生真菌芽枝霉菌产β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了研究，结果显示，该酶在pH 4.0～9.0范围内，60℃以下酶活力稳定。郑芳等[18]分离筛选出一株高产β-葡萄糖苷酶的芽孢杆菌，其产β-葡萄糖苷酶最适反应pH值和温度分别为7.0和40℃。

本研究从酿造用酒曲中分离筛选出产β-葡萄糖苷酶的菌株，经过菌种筛选分离培养基、菌种筛选透明圈培养基筛选出一株产β-葡萄糖苷酶菌株L1，对L1其进行形态学观察及分子生物学鉴定，将其鉴定为真菌门（Fungi），半知菌类（Fungi imperfecti），丛梗孢目（Moniliales），丛梗孢科（Moniliaceae），曲霉族（Aspergilleae），曲霉属（Aspergillus），烟曲霉（Aspergillus fumigatus），并对菌株L1发酵所产β-葡萄糖苷酶酶学性质进行了研究，其最适反应温度为50℃，热稳定性较好，50℃保温120 min仍能保持79.6%酶活性；最适反应pH值为4.0，在pH值3.0～5.0之间酶活性稳定。

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Identification of β-glucosidase producingAspergillus fumigatusand its enzyme production characteristics

LIU Dehai1,MA Huan2,XIE Fuhong2,QUAN Shujing2,JIA Bin2,WANG Hongyun1,CHEN Guocan1
(1.Henan Academy of Science Institute of Biology,Limited Liability Company,Zhengzhou 450008,China; 2.Henan Engineering Research Center of Industrial enzymes,Zhengzhou 450008,China)

A β-glucosidase producing strain L1 was screened from Daqu.By physical characterization and 18S rDNA molecular identification,the strain L1 was identified asAspergillus fumigatus.The enzymatic characteristics of β-glucosidase were studied as well,and the results showed that the optimum reaction temperature and pH were 50℃and 4.0.After incubation at 50℃for 120 min,it remained 79.6%of its activity.The enzyme was stable in the range of pH 3.0-5.0.

Aspergillus fumigatus;β-glucosidase;isolation and identification;enzyme activity

TQ920.1

A

0254-5071（2015）06-0118-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.026

2015-06-03

河南省中国科学院成果转移转化中心项目（2014308）；河南省工程技术研究中心专项资金项目（132102213112）

刘德海（1970-），男，研究员，本科，主要从事酶工程研究工作。