不同添加物对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素产量的影响

胡久平，赵 辉，周礼红，刘 敏，陈发贵，戚珊珊，熊 燕

（1.西藏月王生物技术有限公司，西藏拉萨850000；2.青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心，西藏拉萨850000；3.拉萨市青稞发酵工程研究技术中心；西藏拉萨850000；4.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳550025）

不同添加物对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素产量的影响

胡久平1，2，3，赵 辉1，2，3*，周礼红2，4，刘 敏1，2，3，陈发贵1，2，3，戚珊珊1，2，3，熊 燕1，2，3

（1.西藏月王生物技术有限公司，西藏拉萨850000；2.青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心，西藏拉萨850000；3.拉萨市青稞发酵工程研究技术中心；西藏拉萨850000；4.贵州大学生命科学学院真菌资源研究所，贵州贵阳550025）

研究不同物质及添加量对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量的影响，并对影响虫草菌素产量的培养基配方进行优化。结果表明，蔗糖、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、链霉素分别作为碳源、氮源、无机盐和生长因子有利于青稞蛹虫草子实体虫草菌素的合成、累积，且作用显著。通过正交试验确定不同物质对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量影响的主次因素为蔗糖＞蚕蛹粉＞磷酸二氢钾＞链霉素＞硫酸镁＞酵母膏，各物质最佳添加量为蔗糖30 g/L，蚕蛹粉7.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，链霉素2.0 g/L，硫酸镁1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在优化配方条件下，青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量可达8 215 mg/kg。

青稞蛹虫草；子实体；虫草菌素；正交试验

虫草素（cordycepin）即3'-脱氧腺苷（3'-deoxyadenosine），又称虫草菌素是由蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]的培养滤液中分离得到的，虫草菌素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素[1-2]。虫草菌素具有多种生物活性，研究表明，虫草菌素能特异抑制人宫颈癌细胞（Hela）信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）转录[3]，影响Hela细胞MMP-9、TIMP-1及TIMP-1mRNA的表达，国产虫草菌素可以剂量依赖方式抑制肿瘤细胞的生长，通过上调TIMP-1mRNA及蛋白的表达发挥潜在的抗肿瘤细胞侵润转移的作用[4]。虫草菌素有降血糖和降血脂的作用，这为糖尿病和高脂血症新药开发提供了依据[5-7]。虫草菌素还具有抗病原微生物、抗炎、抗白血病等药理作用。近年来，国内外研究者在蛹虫草菌株的诱变筛选和虫草菌素的发酵条件优化方面做了大量研究[8-9]，但虫草菌素产量依然不高。为了提高蛹虫草固体发酵产物中虫草菌素产量，本研究以从青藏高原分离获得的具有高产虫草菌素潜力的蛹虫草（Cordyceps militaris）菌株YWCM-1为试验菌株，探讨不同添加物及添加量对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量的影响，以期通过添加不同物质提高青稞蛹虫草子实体中虫草菌素的含量，为青藏高原青稞蛹虫草发酵生产虫草菌素的产量提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]菌株YWCM-1由青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心分离保存。青稞、蚕蛹粉：市售。

1.1.2 试剂

虫草菌素（cordycepin）标准品：美国Sigma公司；葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、链霉素、柠檬酸铵、琼脂粉、麦芽糖、酵母膏等试剂均为分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.3 培养基

菌种活化培养基采用沙氏琼脂改良培养基：麦芽糖5 g，葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉40g，水1 000 mL，pH自然。

改良沙氏液体培养基：麦芽糖5 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH自然。

发酵培养基：蛹虫草固体发酵基质为破碎的青稞。营养液配方为葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，无水硫酸镁0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，酵母膏5.0 g/L。基质与营养液的质量比为1∶1.5，初始pH自然，无色玻璃瓶容积为350 mL（内径6.2 cm，高15 cm），以聚乙烯膜封口，121℃灭菌30 min。

1.2 仪器与设备

1260安捷伦高效液相色谱：安捷伦科技有限公司；DH-360A电热恒温光照培养箱：北京科伟兴仪器有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；TS-2012恒温振荡器：上海天呈实验仪器制造公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；ZK-82A型真空干燥箱：上海鸿都电子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化和种子液的制备

菌种活化：将菌株YWCM-1接种于活化培养基上进行菌种活化，先25℃，避光培养5 d，再25℃连续光照（光强600 lx）培养1 d至菌落完全变色。

种子液制备：以50 mL无菌水洗活化后斜面上菌株孢子，制成终浓度为106个/mL的均一孢子悬液。将种子液按照体积分数5%的接种量接种于添加0.2%青稞粉的改良沙氏液体培养基中，25℃、160 r/min条件下避光培养4 d，制得种子液。

1.3.2 蛹虫草固体发酵产子实体

按照10%接种量将种子液接种于添加营养液的青稞基质上，先25℃避光培养5 d，然后连续光照2 d至菌丝完全变为橙黄色；再进行间断光照和变温培养（每天光照18 h，光强600 lx；光照培养温度为25℃；避光培养6 h，培养温度为15℃）30 d后收取子实体，用于虫草菌素检测，每组10个平行，结果取平均值。

1.3.3 样品虫草菌素测定

将收获的子实体于60℃真空干燥，粉碎；蛹虫草子实体中虫草菌素含量通过高效液相色谱法测定[10]。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-水=5∶95（V/V），用前过0.45 μm滤膜，脱气；流速1.0 mL/min；柱温35℃；检测波长260 nm；进样量10 μL。

虫草菌素含量计算公式如下：

式中：W为虫草菌素的含量，μg/kg；A为试样中虫草菌素的峰面积；As为标准工作样中虫草菌素峰面积；ρs为标准工作液中虫草菌素的质量浓度，μg/mL；V为试样液最终定容体积，mL；f为样品稀释倍数。

1.3.5 不同组分种类的单因素试验

分别以葡萄糖、蔗糖、葡萄糖/蔗糖（1∶1）代替原营养液中的碳源，添加量均为20 g/L；以蛋白胨、蚕蛹粉、蛋白胨/蚕蛹粉（1∶1）代替营养液中的氮源，添加量均为10 g/L；以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾代替原营养液中的磷酸盐，添加量均为1.0 g/L，以柠檬酸铵、链霉素为生长因子，添加量均为1.0 g/L，培养基质与各添加物组成的营养液的质量比均为1∶1.5，以青稞蛹虫草子实体虫草菌素含量为评价指标，对添加物种类进行筛选，按蛹虫草固体发酵产子实体的方法进行。

1.3.6 营养液配方优化

在单因素试验基础上，以青稞蛹虫草子实体虫草菌素含量为评价指标，对蔗糖、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、链霉素、酵母膏、硫酸镁等6个因素进行优化正交试验，每个因素选择3个水平，按L27（36）正交表设计试验，各因素与水平见表1。

1.3.7 统计分析方法

本研究中所有的试验设计和数据皆采用Minitab 16.0进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 碳源、氮源、磷酸盐、生长因子的单因素试验

以蛹虫草固体发酵产子实体的方法，进行单因素试验对影响青稞蛹虫草子实体中虫草菌素物质种类进行筛选，结果见图1。

由图1可知，不同添加物对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量影响各不相同。在碳源方面，当以蔗糖为唯一碳源时，其子实体中的虫草菌素含量最高，由此可知，在以青稞为发酵基质的蛹虫草子实体发酵中蔗糖是其产虫草菌素的最适碳源，这与MAO X B等[9，11-12]研究结果有所出入。这可能是因为本研究是以青藏高原特有的农作物青稞为发酵基质，较其他研究者所使用的大米、玉米、高粱米等发酵基质其营养成分有所差别。在氮源方面，当以蚕蛹粉为唯一氮源时蛹虫草子实体中虫草菌素含量最高，表明蚕蛹粉是青稞蛹虫草子实体合成累积虫草菌素的最适氮源。在磷酸盐方面，磷酸二氢钾比磷酸氢二钾更有利于蛹虫草子实体中虫草菌素的合成累积，这与文庭池等[13]的研究结果有所不同，可能是因为在青藏高原缺氧、干燥环境中蛹虫草对磷酸盐的需求有所不同。在生长因子的筛选方面，链霉素在子实体的虫草菌素合成累积方面表现出了明显优势，这与肖正华等[14]在其他发酵基质上的研究结果一致，这表明链霉素为生长因子对蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积确有促进作用。

2.2 营养液配方正交试验优化结果

单因素试验结果表明，蔗糖、蚕蛹粉、磷酸二氢钾、链霉素是影响青稞蛹虫草子实体产虫草菌素的显著因子，另外文庭池等[13，15]的研究表明硫酸镁和酵母膏对蛹虫草产虫草菌素也有较显著影响，因此为了确定这6因素对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量影响，进行正交试验，结果与分析见表2，方差分析结果见表3。

由表2可知，以青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量为评价指标，各因素对子实体中虫草菌素含量的影响程度大小依次为蔗糖＞蚕蛹粉＞硫酸镁＞磷酸二氢钾＞链霉素＞酵母膏。最佳组合为A2B2C1D3E3F2，即添加量为蔗糖30 g/L，蚕蛹粉7.5 g/L，链霉素2.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此最佳配方条件下进行验证试验，虫草菌素的含量为8 215 mg/kg。

由表3可知，蔗糖、蚕蛹粉对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积有极显著（P＜0.01）的影响；磷酸二氢钾和链霉素对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积有显著（P＜0.05）的影响；而硫酸镁和酵母膏对青稞蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积无显著影响。

3 结论

本研究以青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量为评价指标对碳源、氮源、无机盐、生长因子等进行筛选，通过单因素试验确定有利于青稞蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积的碳源为蔗糖、氮源为蚕蛹粉、无机盐为磷酸二氢钾、生长因子为链霉素。筛选出的有利于青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量的物质与以往报道的有同异之处，这从一定程度上表明不同的发酵基质和发酵环境对蛹虫草子实体中虫草菌素的合成累积所需的物质有所影响。通过正交试验获得了以青稞为发酵基质有利于青稞蛹虫草子实体中虫草菌素合成累积的最佳营养液配方为蔗糖30 g/L，蚕蛹粉7.5 g/L，链霉素2.0 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁1.5 g/L，酵母膏2.5 g/L。在此优化配方条件下，青稞蛹虫草子实体中虫草菌素含量可达8 215 mg/kg。本研究为高原环境下青稞蛹虫草子实体产虫草菌素的工业化开发奠定了一定基础。

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Effect of different additives on the production of cordycepin in the fruit body of highland barleyCordycepes militaris

HU Jiuping1,2,3,ZHAO Hui1,2,3*,ZHOU Lihong2,4,LIU Min1,2,3,CHEN Fagui1,2,3,QI Shanshan1,2,3,XIONG Yan1,2,3
(1.Tibet Yuewang Biotechnology Co.,Ltd.,Lhasa 850000,China; 2.National United Engineering Research Center for Tibetan Plateau Microbiology,Lhasa 850000,China; 3.Lhasa Highland Barley Fermentation Engineering Technology Research Center,Lhasa 850000,China; 4.Institute of Fungi Resource,College of Life Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The effect of different additives and additions on cordycepin content of highland barelyCordycepes militarisfruit body was studied,and the medium formula that affect cordycepin production was optimized.Results indicated that sucrose,silkworm chrysalis meal,monopotassium phosphate and streptomycin were the optimal carbon source,nitrogen source,inorganic salt,and growth factor,respectively,which are all significantly beneficial to cordycepin sythesis and accumulation.The orthogonal experiments indicated that the effect of different substances on cordycepin content in order was sucrose,silkworm chrysalis meal,potassium dihydrogen phosphate,streptomycin,magnesium sulfate,yeast extract,respectively.The optimal addition were sucrose 30 g/L,silkworm chrysalis meal 7.5 g/L,monopotassium phosphate 1.0 g/L,streptomycin 2.0 g/L,magnesium sulfate 1.5 g/L and yeast extract 2.5 g/L,respectively.The cordycepin production in highland barelyC.militarisfruit body could reach 8 215 mg/kg at such condition.

highland barleyCordycepes militaris;fruit body;cordycepin;orthogonal experiment

Q815

A

0254-5071（2015）06-0080-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.018

2015-05-27

拉萨市科技计划项目（201410）

胡久平（1986-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程、微生物活性。

*通讯作者：赵辉（1969-），男，经济师，硕士，研究方向为发酵工程、工商行政管理。