动物卵巢组织的冻存技术

李 娜 张云山

1.天津医科大学（300070）；2.天津市中心妇产科医院生殖医学中心

目前，随着放疗和化疗技术不断发展，女性癌症患者存活率大幅度提高。然而，放疗和化疗会对年轻女性患者卵巢功能造成极大损伤，进而使其生育能力显著降低。研究表明，在接受化疗的年轻女性癌症患者中，超过1／3会发展成卵巢早衰［1］；使用标准盆腔放疗剂量将无一例外导致卵巢早衰。因此，癌症治愈后生育力保存就显得尤为重要。目前，人类卵巢组织冻存技术已取得一定进展，但由于受到伦理等问题限制尚缺乏系统研究。而动物繁殖周期短，其卵巢在结构和功能上与人卵巢相似，因此目前研究主要依靠动物实验进行，本文就近年来动物卵巢组织冻存技术综述如下。

1 概述

20世纪30年代，甘油作为冷冻保护剂问世。随后，开始用甘油冻存动物卵巢组织。1960年，Parrott等［2］用甘油冻存小鼠卵巢组织，解冻移植后获得了成功妊娠和分娩。但是由于受当时冷冻保护剂和冷冻设备的限制，解冻后只有10%的原始卵泡存活。随后，乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、二甲基亚砜（DMSO）等新型冷冻保护剂问世，动物卵巢组织冻存的成功率大幅度提高。目前，研究动物卵巢组织冻存最常用模型是绵羊，因为其卵巢体积、组成、卵泡密度和人相近，且绵羊是单排卵动物［3－4］。此外，小鼠、大鼠、兔等也是较常用的动物模型。

保存生育力的方法包括胚胎冻存、卵子冻存和卵巢组织冻存。相对于前两者而言，卵巢组织冻存具有明显优势：①不需要卵巢刺激，可在月经周期任何时间进行；②不需要男方精子，是青春期前女性保存生育力的唯一方法［5］；③卵巢皮质含有大量始基卵泡，其体积较小，冷冻保护剂能迅速穿透其内部卵细胞，和生长卵泡相比，代谢不活跃，透明带缺乏，因此冷冻损伤较小；④卵巢组织冻融移植后可恢复患者内分泌功能。但卵巢细胞种类多，各种细胞的数目、大小、水含量以及对冷冻保护剂的渗透性不同，且存在血管系统，这就势必导致卵巢冻存相对于胚胎冻存和卵子冻存而言难度更大。

2 冻存方法

2.1 慢速程序化冷冻

该方法运用低浓度冷冻保护剂在程序化冷冻保护仪控制下，缓慢降温使细胞充分脱水。脱水过程中，渗透性冷冻保护剂进入细胞内稀释细胞内电解质，使细胞内溶质性和冰晶损伤降到最低，从而保护细胞。较适合冻存体积小、代谢率低、缺乏细胞器和皮质颗粒的始基卵泡。研究表明，慢速程序化冷冻具有以下优势：①已应用多年，技术成熟，效果稳定；②对卵巢皮质中始基卵泡损伤较小；③窦卵泡颗粒细胞和卵泡膜细胞凋亡较少［6］；④溶质扩散更好。但该方法也有其局限性：①对卵巢基质和血管损伤相对较大［7］；②需要较昂贵的程序冷冻仪控制降温速度，耗时长，过程复杂，一般实验室不易实施。

2.2 玻璃化冷冻

该方法运用高浓度冷冻保护剂在快速降温过程中由液态转变为无结构的玻璃化状态或无冰晶结构的固态，减少冷冻过程中冰晶形成，从而降低冷冻损伤。对卵泡存活率的影响目前尚无定论。研究显示该方法冻存卵巢组织后卵泡存活率与慢速程序化冷冻接近，也有学者认为，解冻后的卵泡存活率较慢速程序化冷冻更高（分别是89%和42%）［8］。另有研究表明，两者对卵泡形态、超微结构［9］、坏死细胞比例和解冻移植后组织血管再生方面的影响［10］并没有显著差别。目前研究认为玻璃化冷冻具有以下优点：①省时、操作简便、花费少；②降温速度可＞1500℃／min，使胞质内外的水物质迅速通过5～15℃的冷冻敏感区，可最大限度减少细胞内冰晶形成；③对卵巢血管形态损伤较轻。但该方法也有不足之处：①需要高浓度冷冻保护剂，对细胞毒性作用较强；②卵母细胞胞浆损伤更严重；③解冻后正常窦前卵泡率下降［11］，这是由于细胞暴露在高渗透压环境中、高浓度冷冻保护剂毒性作用［12］、基膜损坏［13－14］等原因引起的。相对于慢速程序化冷冻而言，该方法操作简单，已经在动物模型中取得一定成功。Sugimoto等［15］用该法冻存出生10～12d幼鼠双侧卵巢，解冻后移植到一侧肾囊内，发现其内分泌功能恢复时间与新鲜卵巢组织移植组没有明显差异。

2.3 快速冷冻

快速冷冻法是将卵巢组织置于低钠浓度的冷冻保护剂中，在液氮蒸汽中放置超过12h后投入液氮。该方法冻存效果会因液氮蒸汽发生器的不同而出现结果不稳定现象，所以目前研究较少。

3 影响因素

3.1 冷冻保护剂的选择

冷冻保护剂通过脱水、调整渗透压、减少细胞内冰晶形成和稳定细胞内蛋白质等作用来保护细胞在冷冻复苏过程中免遭损伤，可分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂。前者有DMSO、PROH、EG等，后者有蔗糖、葡萄糖、脂蛋白等。研究显示不同冷冻保护剂冻存卵巢组织后原始卵泡存活率由高到低依次为EG（84%）、DMSO（74%）、PROH（44%）、甘油（10%）［16］。目前，DMSO 和 PROH 是最常 用 的 冷冻保护剂［17］。使用冷冻保护剂的目的是在达到冷冻效果的同时降低其细胞毒性。降低细胞毒性的方法有：①选择毒性较小的冷冻保护剂，如EG、PROH等；②联合应用两种或两种以上冷冻保护剂，既可以降低各冷冻保护剂浓度，又有利于不同性质冷冻保护剂协同作用，如联合应用DMSO、PROH和EG对卵巢组织进行玻璃化冷冻，得到正常卵泡比率可达92.31%［18］；③添加毒性中和剂，如在DMSO中加入适量甲酰胺；④运用毒性小的新型保护剂，如多聚赖氨酸、抗冷冻蛋白等。

3.2 卵巢组织块大小的选择

冷冻前需对卵巢组织进行修整并切割成较小组织块，以剔除不含卵泡的髓质和黄体，利于冷冻保护剂渗透。但研究表明，卵巢组织解冻移植后功能维持时间过短与移植卵巢组织体积偏小有关。Baird等［19］用小皮质块冻存方法冻存绵羊卵巢组织，解冻自体移植后4个月卵巢功能恢复，但只维持了两年。因此，为了使移植后卵巢功能维持更长时间，应在保证卵泡存活率前提下，尽量增加皮质块体积［20］。但皮质块越大，冷冻效果越差，且解冻移植后血管形成所需时间越长，缺血再灌注损伤越严重。Kagawa等［21］将牛卵巢组织切割成1mm×10mm×10mm大小行玻璃化冷冻，解冻后卵母细胞存活率89%。Nyachieo等［22］将东非狒狒卵巢组织切割成1mm3组织块行玻璃化冷冻，解冻后卵泡存活率67.1%。理论上，卵巢组织块越薄越有利于冷动保护剂渗入，但若组织块太小，会在切割过程中造成过多卵泡丢失。因此，目前认为将卵巢组织切成厚约0.75～1mm，表面积1mm2～1cm2大小时冷冻效果最好。

3.3 冷冻损伤

冰晶形成、冷冻保护剂的毒性作用、细胞凋亡以及移植后缺血和缺氧损伤是导致卵泡大量丢失的主要原因。冷冻过程中，随着温度降低到冰点以下，细胞内的水会形成细胞内冰晶。微小的冰晶对细胞没有明显损伤作用，但冰晶越大，对细胞造成的损伤也越大。冰晶主要通过机械作用损伤细胞膜及其他细胞器的膜性结构，并对细胞内的各种细胞器和细胞骨架造成挤压。

冷冻保护剂为化学物质，会对细胞造成一定损伤。DMSO作为最有效的冷冻保护剂已被应用多年，但是研究表明其毒性较大而且会影响细胞的分化过程［23］。Demirci等［24］在研究绵羊卵巢组织冻存实验中发现PROH和DMSO会导致细胞萎缩、细胞质空泡形成和细胞核固缩。Oskam等［25］发现应用PROH冻存卵巢组织会使正常形态窦卵泡比例显著下降，且造成严重的间质损伤。

Mazoochi［26］等发现小鼠卵巢组织冻存后凋亡相关因子表达增强，说明凋亡也是引起冻存过程中卵泡丢失的主要原因。Choi等［27］研究发现慢速程序化冷冻及玻璃化冷冻均会抑制小鼠卵巢中始基卵泡发育，使细胞凋亡率增加。Xiao等［28］通过针形浸润玻璃化法（NIV）冻存卵巢组织，发现随冷冻保护剂浓度降低，凋亡率显著下降，说明冷冻保护剂的毒性作用是引起凋亡的原因之一。

卵巢组织冻存后主要用来移植或体外培养。因为卵巢皮质块移植没有血管吻合，移植后血供完全依靠周围毛细血管生长，所以移植后最初一段时间处于缺血、缺氧状态。原始卵泡可耐受局部缺血至少4h，而间质组织对局部缺血更加敏感。Baird等［19］冻存绵羊卵巢组织发现，因移植后缺血导致的卵泡丢失远远大于低温冷冻造成的损伤。Lee等［29］研究小鼠卵巢组织冻存时也发现，卵泡大量丢失主要发生于移植过程。因此，通过缩短移植后血管再生时间来降低缺血、缺氧引起的卵泡丢失成为研究的热点。

4 降低冷冻损伤的新型化合物

4.1 抗冷冻蛋白

抗冷冻蛋白的主要成分是糖肽类，其不仅可以通过吸附－抑制机制抑制冰晶生长，而且可以保护细胞膜结构完整性，是目前在研的一种理想冷冻保护剂。Martínez－Páramo等［30］研究表明在斑马鱼胚胎早期向其中导入抗冷冻蛋白，能够有效增强细胞保护作用。Bagis等［31］对携带转抗冷冻蛋白基因小鼠的卵巢组织进行冻存，发现抗冷冻蛋白明显提高了冷冻效果。但是抗冷冻蛋白是从极地鱼、过冬昆虫等生物体中提取和纯化出来的，进行大规模生产时费用昂贵。

4.2 多聚赖氨酸

多聚赖氨酸是一种聚两性电解质，毒性较传统冷冻保护剂小。因氨基和羧基比列恰当，使其表现出较理想的冷冻效果。Matsumura等［32］发现多聚赖氨酸可有效防止冰晶形成，效果优于DMSO。同时，多聚赖氨酸具有和抗冷冻蛋白相同的吸附作用，因此能更好地保护细胞膜结构的完整性。

4.3 动物血清

动物血清中含有血浆蛋白、碳水化合物、生长因子及无机物等，是一种复合型冷冻保护剂。在冷冻液中加入动物血清，可降低其他冷冻保护剂的毒性。目前，应用最广泛且冷冻保护效果较佳的是胎牛血清。Carvalho等［33］用玻璃化冷冻法冻存山羊卵巢组织，发现含0.25mol／L蔗糖及10%胎牛血清的冷冻保护剂效果最佳。Lunardia等［34］用六种不同玻璃化液冻存山羊卵巢组织，发现含6mol／L EG、0.25mol／L蔗糖以及10%胎牛血清的玻璃化液效果好。然而，动物血清在具有较好冷冻保护作用的同时，也存在弊端，即来自动物的血清在临床使用会增加感染风险。因此，如何在使用动物血清作为冷冻保护剂的同时降低其感染风险，是亟待解决的问题。

4.4 海 藻 糖

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过糖苷键连接成的非还原性糖，其细胞毒性较小且自身性质稳定，在低温、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下，能在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而对细胞膜起到保护作用，而且海藻糖可以在冷冻过程中形成稳定的玻璃化状态［35］，是一种天然的冷冻保护剂。

5 总结

卵巢冷冻保存虽然处于试验阶段，但是因其不会延误癌症患者治疗时间以及冻融移植后可恢复卵巢内分泌功能等优势而具有广阔应用前景。目前，卵巢组织冻存已经在大量动物实验中取得了一定成功，为年轻女性癌症患者，尤其是青春期前女性和未婚女性带来了曙光。但如何降低冷冻损伤仍是目前面临的主要问题。相信随着科学技术的不断发展，卵巢组织冻存技术定会日趋完善，从而为人类生育力保存做出巨大贡献。

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