磷脂脂肪酸技术在食品微生物检验中的应用

黄 结，毛瑞丰

（广西大学 轻工与食品工程学院，广西 南宁 530021）

食品安全是人们赖以生存和发展的基础。食品微生物是影响食品安全的重要因素之一。在食品快速流通及广泛工业化生产的今天，使用简便、准确的食品微生物检验方法是保障食品卫生安全的重要途径。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）技术是一项新兴技术，具有简便、快速、准确、可重现等特点。该技术在土壤微生物[1-4]、沉积物微生物[5-6]和地下水微生物[7]等方面已有了很广泛的应用。但在食品微生物中的应用报道并不多。该文对PLFA技术的基本原理和方法及其在食品微生物鉴定、分型、溯源和群落结构分析中的应用进行了综述，为促进该技术在食品微生物检验方面起到更大的作用。

1 磷脂脂肪酸（PLFA）技术的基本原理和方法

1.1 基本原理

磷脂脂肪酸（PLFA）是构成活体微生物细胞膜的重要组成部分，在真菌和细菌的细胞膜中PLFA分别约占50%和98%[8]。微生物能通过不同的生化途径合成不同的PLFA，且细胞膜中PLFA的成分和含量是相对稳定的，提取之后易于进行定性和定量研究[6]。微生物中的PLFA在细胞死亡后数分钟到数小时内就会降解，因此检测到的PLFA大体上反映的是活体微生物。

不同类群微生物含有PLFA的种类和数量均不相同，a15/i15/15：0、a16/i16/16：0、16：1w5/1w9/1w7t、a17/i17/17/cy17：0、18：1w5/1w7/1w7t、a19/i19/cy19：0为细菌的PLFA；18：1w9/2w6/3w6/3w3为真菌的PLFA；10Me16/10Me17/10Me18：0为放线菌的PLFA。此外，部分PLFA仅特异性地存在于某类群微生物的细胞膜中，如cy17：0和cy19：0是厌氧细菌的PLFA；16/18：1w7t是好氧细菌的PLFA。鉴于PLFA和微生物类群存在的对应关系，可以通过分析样品中的PLFA来研究样品中微生物的生物量和群落结构，可以通过分析PLFA构成的变化来研究微生物群落结构的变化[6]。

1.2 方法

应用该技术首先需要从样品中提取PLFA。PLFA的提取和测定是PLFA技术的关键。PLFA的提取可以参考微生物鉴定自动化系统（microbial identification system，MIS）推荐的提取方法进行。目前，美国的MIDI公司已将PLFA技术商品化，开发了微生物鉴定自动化系统。该系统是依据不同种类微生物PLFA类型和含量的特异性、指示性和稳定性，对微生物进行全自动鉴定和分析。该系统从微生物的培养、菌的收集、微生物细胞皂化释放脂肪酸、脂肪酸甲基化、脂肪酸甲酯的萃取和洗涤、微生物的鉴定、结果的判断等制定成一整套完整的标准化程序。系统检测出微生物的磷脂脂肪酸图谱，然后自动检索其内置的PIFA图谱数据库进行匹配，给出匹配结果，完成微生物的鉴定。然后可经百分归一化处理，给出相对定量数据。若鉴定的是样品微生物群落，可根据得到的磷脂脂肪酸图谱多样性，通过相关数据库和计算机分析软件等给出样品微生物的生物量及群落结构多样性。

2 PLFA技术在食品微生物检验中的应用

2.1 食品微生物的鉴定

目前，食品微生物的鉴定法大体分成4个不同水平：菌落、细胞形态和生理生化水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因水平。传统的形态、生化鉴定操作繁琐、费时、灵敏度低，一旦某些表型和生化特征发生变化，其分类与命名就易出错[9]；采用分子生物学技术，通过DNA或RNA进行鉴定，其操作技术要求高，且不能区分活体与死体DNA，引物序列设计具有人工选择性。PLFA技术是从细胞组分水平上鉴定微生物，微生物细胞结构中普遍含有PLFA成分，且微生物的PLFA与DNA具有高度的同源性[10]。PLFA的组成和含量是相对稳定的，一般可通过单次试验就能比较准确地将微生物鉴定到种[11]。汤丹剑[12]对食品中常见的8株细菌（保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌）的细胞脂肪酸成分进行检测分析，其结果与传统分类鉴定方法所得的结果相符。ODUMERU J A等[13]采用MIS系统对蜡样芽胞杆菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌属、产毒大肠埃希菌等6种食源性病原菌进行鉴定，结果表明，MIS鉴定的重复性蜡样芽胞杆菌最好，其次为空肠弯曲菌、沙门菌属。杜春明等[14]对不同食物来源的唐菖蒲伯克霍尔德菌中不同致病型菌株的脂肪酸成分进行测定分析，发现它们的脂肪酸成分基本一致，进一步证实了唐菖蒲伯克霍尔德菌、椰毒假单胞菌和椰毒假单胞菌酵米面亚种是属于同一个种。郭爱玲等[15]通过气相色谱对食品中常见并已知的15株革兰氏阴性致病菌的细胞脂肪酸组分进行分析，可以清晰的分出不同属和不同种之间有明显的差异。HOFFMANN M等[16]使用脂肪酸甲酯鉴定分析从食品和环境中分离的30株阪崎肠杆菌，得出脂肪酸的测定有高度重复性，可用于快速检查婴幼儿配方样品中的阪崎肠杆菌。吕均等[17]对武汉市疾病预防控制中心从食品及食品中毒中检验分离出的14株病原菌及其所属种的模式菌株，用气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）对其进行全细胞脂肪酸组分的分析，结果表明，各个属之间可通过特征脂肪酸图谱鉴定出来，并可通过双键脂肪酸上的位置差异鉴定出模式菌株与地方菌株。

2.2 食品微生物的分型

PLFA图谱对菌株差异非常灵敏，已成功应用于食品微生物的分型研究。郑华英等[18]对食品中分离出来的6种沙门氏菌（伊斯特尔本沙门菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、阿贡纳沙门菌、彻斯特沙门菌、鸭沙门氏菌）在相同的条件下培养，通过气相色谱测定脂肪酸的组成，结果表明，沙门菌属中的细菌在脂肪酸的组成上主要含C12、C16、C18、C19，伊斯特尔本沙门菌、猪霍乱沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、阿贡纳沙门菌、彻斯特沙门菌、鸭沙门氏菌的气相色谱图极其相似，但又并不是完全相同，在组分及含量上表现出一定的差异。秦巧玲等[19]用气相色谱-质谱分析4种已知的志贺氏菌（其中的地方菌株是从食品中分离得到），志贺氏菌脂肪酸成分都具有一定的特征，4个种之间也表现出一定的差异，同种不同来源的地方菌株表现出一定差异。GUO A等[20]通过微生物鉴定系统MIS对不同食物来源中分离的22株单核细胞增生李斯特菌进行全细胞脂肪酸鉴定分析，结果表明，基于这22株菌的脂肪酸可分成三大组，发现这跟食物来源也密切相关，同一食物源在同一组，不同食物源在不同组。狄慧玲等[21]对从河北地区六类食品中分离得到的90株单核细胞增生李斯特菌（LM）提取脂肪酸，利用MIDI公司Sherlock系统进行菌体脂肪酸成分分析，使用SPSS19.0软件对获得的数据资料进行统计分析及聚类分型，并将脂肪酸分型与传统的血清分型和分型金标准脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）分型进行比较，结果表明，脂肪酸分型法判定LM菌的符合率为96.67%。

2.3 食品微生物的溯源

同种不同来源菌株的PLFA组分存在细微差异，对这些差异数据进行聚类分析，可判断出菌株间的亲缘关系。赵晖等[22]对美国典型培养物保藏中心和中国典型培养物保藏中心各一株标准菌株及从食品中分离的5株单核细胞增生李斯特菌进行脂肪酸组分分析，结果表明，同种的大部分主要脂肪酸组分是相同的，但不同来源的菌株间一些微小的脂肪酸组分有差异。因而可以通过脂肪酸组分的微小差异对微生物追踪溯源。

在食品加工中应用该技术进行菌株溯源分析，对推测污染源、明确污染途径、预防和消除产品受微生物破坏等方面具有重要意义。MALFEITO-FERREIRA M等[23]在葡萄酒装瓶厂和葡萄酒中的菌株进行脂肪酸图谱检测，追踪破坏最终产品的菌株来源，结果表明，在精过滤器的出口确定为接合酵母的来源，灌装机的入口发现毕赤酵母的来源。这给厂家消除产品的有害菌株提供了指导方向。HINTON A等[24]使用MIDI脂肪酸甲酯分析对某商家的家禽加工中的鸡肉和烫伤水从一月～六月进行弯曲杆菌的监测，结果表明，从三月～六月的鸡肉和烫伤水中检出病原体，且弯曲杆菌的数量在家禽尸体冷藏储存期间普遍下降，这可以帮助商家明确污染源，为预防和减少病原体采取必要的措施。该技术也可以应用在细菌性食物中毒查找污染源中，但是这方面的报道甚少。该技术可以作为一种简便、经济的手段快速找出相似菌株，再结合使用脉冲场凝胶电泳（PFGE）法对相似度高的菌株进行验证试验，从而为有效提高污染源的控制缩短时间。

2.4 食品微生物群落结构的分析

微生物群落结构可通过各微生物类群的特征脂肪酸的相对含量表征[25]。目前，PLFA只能粗略地区分革兰氏阳性菌G+、革兰氏阴性菌G-、好氧细菌、厌氧细菌、真菌等。微生物多样性一直是微生物生态学研究的重要内容。分析食品不同时期的微生物群落结构含量变化是反映食品质量变化的重要指标，这在食品加工、贮存等方面具有重要的指导意义。赵金松等[26]采用PLFA技术对4种不同的酱香型大曲进行研究，结果表明，酱香大曲主要由真菌、G+细菌、G-细菌等组成，优势菌群均为真菌，总PLFA含量表现为泸州老窑大曲＞国台大曲＞郎酒大曲＞仙潭大曲。

3 PLFA技术存在的不足

虽然PLFA技术应用于微生物研究已有了很长时间，但也有不足。

（1）不同种属之间的PLFA常常会有所重叠，这个覆盖效应在鉴定微生物群落结构上会导致生物量的过量估算[27]。

（2）PLFA的组成会受细胞所处的外部环境条件的影响，也会受细胞内部情况的影响[28-29]。有研究指出，一些菌株的细胞脂肪酸组成和含量会随着环境的温度、pH值、培养时间、摇瓶转速、碳源种类和浓度等变化而变化[30-32]。

（3）古菌的极性脂质是以醚键（二醚与四醚成分）为主[33]，而不是以酯键的形式出现，因此不能使用PLFA技术分析古菌的组成。

（4）对某些菌落指征有时不够准确，且食品中所有生物的特征PLFA未完全确立。因此还要不断完善PLFA技术，完善不同菌种的特定PLFA数据库。

4 展望

随着生物技术的不断发展，PLFA技术越来越多地引起人们的重视。PLFA技术突破了传统食品微生物检测手段的限制，已越来越多地应用于食品微生物的鉴定、分型、溯源和群落结构的研究中。由于PLFA技术只检测活的那部分微生物，并且能有效地提供微生物群落信息，所以，该技术可以用来研究发酵食品加工中特异性微生物群落的动态变化，为控制和保证产品的质量提供技术支撑。由于该技术存在一些不足，可研究改进试验方案，不断完善PLFA技术，并且在进行食品微生物溯源、群落组成及变化等研究中，需要与其他技术方法结合起来使用，如核酸技术、变性凝胶梯度电泳技术（denatruing gradient gel electrophoresis，DGGE）等，以达到更好的使用效果。

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