纳米生物传感器在食品分析中的应用研究进展

丁 亮，吴秀莲

（南京市质量技术监督局 高淳区质量计量检测所，江苏 南京 211300）

纳米生物传感器（nanobiosensors）是将分子生物学与信息技术相结合，将生物物质浓度转换为电信号进行检测的仪器。生物传感器为食品工艺操作者和食品安全局提供了快速检测病原体和潜在污染物的能力，且降低了与食物相关疾病的健康风险及医药成本。尽管目前检测食品病原体的方法有所改进，但为了能简单快速、多功能及廉价的检测食品污染物，当前检测技术的完善仍面临着许多挑战和机遇。

最近，纳米材料在传感器中的应用大幅提升了传感器检测系统的分辨力。目前常用的纳米材料包括磁纳米粒（magnetic nanoparticles，MNPs）、碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）、纳米杆（nanorods，NRs）、量子点（quantum dots，QDs）、纳米线（nanowires，NWs）及纳米通道（nanochannels，NCs）等。这些纳米材料应用于电生物传感器时，具备很高的电荷转移能力，从而具备更低的检测限和更高的灵敏度[1-3]。近几年来，纳米生物传感器在食品工业中的应用，会极大地改善食品的质量控制、食品安全和易加工特性。纳米生物传感器的优势使其可应用于食品行业以下几个方面：原材料预处理、食品加工（质量控制）、储藏条件监测等。纳米生物传感器可达到非常低的检测限（甚至是单个分子或细胞）。此外，它们可提供多种可能性，保证高稳定性（如纳米颗粒量子点比酶或荧光染料要稳定得多）。除了减少试剂用量、检测时间、灵敏度稳定等优势外，其主要优势在于不需要专业使用者操作。

尽管已有很多关于纳米生物传感器的报道[4-6]，该文旨在综述一些比较重要的基于各种检测技术的纳米生物传感器及其在食品领域的应用。

1 纳米生物传感器在食品中的应用

近几年，新型的纳米材料被广泛应用于电极表面改造，使得生物分子达到更快的电荷转移能力及更高的特异性。这一应用也激发了纳米生物传感器与生物分子相结合的研究。这些生物传感器已被应用于不同的领域，如食品质量检测、临床分析和环境控制。随着各种微型化、集成化、智能化、实用化的生物传感器的开发与应用，相信纳米生物传感器的面貌将会焕然一新。

生物传感器的分子识别元件中，酶[7]、抗体[8]或脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列[9]与纳米材料如金属金（Au）纳米粒子（nanoparticles，NPs）、单壁碳纳米管（single-walled carbon nanotube，SWCNTs）、多壁碳纳米管（multi-walled Carbon nanotubes，MWCNTs）、碲化镉（CdTe）量子点（quantum dots，QDs）纳米粒子等的结合为食品应用提供了一个新的整合系统，其将纳米材料的传导体和半导体特性与生物材料的识别和催化性质相结合，为纳米生物传感器在食品检测中的应用奠定了更坚实的基础。生物传感器在食品化学研究中应用也日趋增加，如在酒行业或其他行业中的应用[10]。

2 纳米电化学生物传感器

电化学生物传感器是一种应用最广、数量最多且成功商业化的生物传感器，其主要依赖于生物分子电极，特别是电流式的电化学生物传感器，具备更优的灵敏度和更好的线性范围[11-12]。此外，它们也有比光学设备更具优势的地方，如成本低，操作简单，体积小，在单芯片装置中任意组装多种传感元件[13]。将纳米材料引入电化学生物传感器和生物传感器，其带来了更多优势：降低了许多分析上的重要电化学反应的多种潜在可能，保证一些氧化还原反应的可逆性（其在未改变电极时是不可逆的），多检测能力。

2.1 杀虫剂

由于大部分杀虫剂水溶性较高，毒性大，在农业中应用广泛。因此，急需高灵敏度和高特异性的检测方法检测这些污染物的残留[14]。基于乙酰胆碱酯酶抑制的生物传感器可以检测其抑制剂，如有机磷酯酶和氨基甲酸盐杀虫剂，广泛用于含磷化合物的检测[15-17]。袁永海等[18]综述了电化学生物传感器在农药检测中的广泛应用。用碳纳米管（CNTs）改造的传感器检测有机磷（organophosphorus，OP）杀虫剂较电流生物传感器有很多优势，DEO R P等[19]利用这些优势发展了基于有机磷水解酶（organophosphorus hydrolase，OPH）的生物传感器，用来检测对氧磷。VISWANATHAN S等[9]报道了一种乙酰胆碱酯酶生物传感器，其固定化聚苯胺，垂直放置于装有含巯基的单链寡核苷酸的单壁碳纳米管上，用它检测蔬菜中有机磷农药：甲基对硫磷和毒死蜱。含巯基的单链寡核苷酸-单壁碳纳米管通过Au-S化学键固定在金属表面。随着该设备的发展，单壁碳纳米管的引入，不仅促进了电荷转移，而且增加了三维传导支持物与乙酰胆碱酯酶接触的表面。通过抑制酶反应检测甲基对硫磷和毒死蜱，因为有机磷酸酯或氨基甲酸盐杀虫剂存在时，正常的乙酰胆碱酯酶活性改变，从而降低了生物传感器的信号。该信号的降低程度与杀虫剂浓度有关。

2.2 病原菌

食物传播的疾病主要是由被细菌、病毒或寄生物污染的食物引起。近几年由食物传播疾病引发的死亡率逐渐升高。在食物中发现和研究最多的是沙门氏菌（Salmonella spp.）、大肠杆菌（Escherichia coli）和李斯特菌（Listeria monocytogenes）。然而，其他会污染食物的病原菌也有呼吸道合胞病毒和寄生生物，如隐孢子虫属（Cryptosporidium）和贾第虫属（Giardia）[20-21]。因此，利用快速、灵敏、特异性强和廉价的分析方法检测这些微生物污染物是十分有必要的，而不仅仅是提供测试微生物的定性或定量信息。基于纳米材料的生物传感器已被应用于病原体检测。生物传感器的识别原件主要在于纳米材料表面，通过信号转导机制检测杂合表面与病原体相互作用[22]。

结合抗体的纳米颗粒在检测沙门氏菌（Salmonella spp.）中可显示免疫过程优势。如DUNGCHAIA W等[6]用金属纳米材料检测伤寒沙门氏菌，将单克隆抗体固定化于聚苯乙烯微孔，捕获伤寒沙门氏菌。之后加入多克隆抗体-胶体金结合物，以固定住伤寒沙门氏菌，随后抗坏血酸维生素C和硫酸铜加入聚苯乙烯微孔，抗坏血酸维生素C将Cu2+还原为Cu，而Cu附于金属纳米材料标签上。释放的铜离子可通过电压检测，而铜则于金属纳米材料标签相关。因此，该设备科用于检测伤寒沙门氏菌含量，如今检测限可达98.9 CFU/mL。YONG G J等[23]将沙门氏菌单克隆抗体固定于金纳米颗粒，利用电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy，EIS）技术检测沙门氏菌与单克隆抗体的相互作用。电容型免疫传感器与聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）方法相比，具有高非特异性相互作用和分析时间短（40 min）的优势。

2.3 糖类

实时检测碳水化合物的水平对发酵过程是有必要的。当糖浓度较低会降低发酵产量时，糖水平就是一个限制因素。基于此，很多电流式生物传感器结合葡萄糖氧化酶来检测葡萄糖，结合牛乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶来检测乳糖，结合牛乳糖苷酶和果糖脱氢酶来检测乳果糖。OZDEMIR C等[7]发现了一种结合金（Au）纳米粒子（NPs）和吡喃糖氧化酶的生物传感器，其对D-葡萄糖亲和力强，应用于果汁检测。Au NPs显示很好的生物兼容性及职能化能力，可使固定的酶稳定于操作环境，使得其在生物传感器中快速、稳定的反应。ZHAO Z等[24]为检测葡萄糖构建了一种固定化葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）到氧化锌（ZnO）：钴（Co）纳米薄层的电流生物传感器，这两种报道的生物传感器的电化学反应具备很高的灵敏度，最低检测限分别达到1 μmol/L和20 μmol/L。

虽然蔗糖是最常用的食品甜味剂，但果糖同样重要。ANTIOCHIA R等[25]报道用CNTs作为传导纳米材料的电流生物传感器检测蜂蜜中的果糖。该传感器中，电极表面上部置有固定了3,4-二羟基苯甲醛和D-果糖脱氢酶的电子聚集膜，该膜与CNT黏结，从而进行传导。用该传感器检测真实样品中的果糖，线性范围好，检测限较传统固体电极低了一个数量级。TOMINAGA M等[26]研究了吸附有果糖脱氢酶的MWCNTs的混合电子转移反应，结果显示，催化氧化电流与银/氯化银/饱和氯化钾（Ag/AgCl/sat’d KCl）相比校正-0.15 V，这相当于亚铁血红素C的氧化还原能力。

3 光纤纳米生物传感器

光学传感器是通过检测分子识别元件与底物（待测物）特异结合后产生的可以输出的特征光学信号（荧光、颜色变化等），来分析检测待测物的传感器。其主要包括光纤荧光生物传感器、光纤免疫传感器以及最近才发展起来的无转换器的细胞内生物传感器、分子信标传感器、DNA光纤生物传感器等[27]。光纤纳米生物传感器在食品、生物医药、卫生护理、医药品和环境监测中应用广泛。纳米材料如金纳米粒子（Au NPs）、四氧化三铁磁纳米粒（Fe3O4）MNPs和QDs具有很好的光学特性，可提高生物传感器光纤传感器表面的灵敏度。

3.1 杀虫剂

有机磷（OP）神经毒素是一类独特的污染物，毒性极强。这些毒素可有效抑制酯酶活性，如乙酰基胆固醇和丁酰胆固醇或神经毒性酯酶。如今有利用荧光试验检测有机磷神经毒素的方法，其利用有机磷水解酶（OPH）特异性识别有机磷的原理。VINAYAKA A等[8]用基于竞争性荧光免疫的生物传感器检测2,4-二氯苯氧基乙酸，纳米材料为CdTe QD。2,4-二氯苯氧基乙酸除草剂即使在很低剂量时，也可损害人体健康。因此，在食品分析中能快速检测低水平的除草剂是很重要的。荧光免疫试验用固定有抗-2,4-二氯苯氧基乙酸抗体的免疫反应器，可检测250 pg/mL的2,4-二氯苯氧基乙酸。SIMONIANA A等[28]发展了一种快速检测有机磷神经毒素（如对氧磷）的生物传感器，该传感器是基于有机磷水解酶竞争性抑制剂的荧光变化，该抑制剂可被有机磷的底物取代，而荧光强度与溶液中对氧磷浓度相关。LEBLANC R M 等[29]报道了基于QDs/OPH的生物传感器检测对氧磷。

3.2 病原体

光纤技术利用荧光和表面等离子供体更广泛用于病原体检测。这些技术依赖于检测发生在功能化纳米材料和病原体之间的光学信号变化。已有报道通过检测有机染料释放的荧光[30-31]或蛋白质荧光[32]来检测细菌的光纤传感器。MNPs表面积/体积比高，具有更大用于捕获细菌的碳水化合物接触的表面。基于此，EL-BOUBBOU K等[33]利用免疫荧光显微镜检测大肠杆菌。该方法通过酰胺键将MNPs和D-甘露糖（D-mannose）的接触表面缩小，随后与荧光素标记的伴刀豆球蛋白A混合12 h，之后培养溶于磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中的大肠杆菌（E.coli）细胞。将MNPs与大肠杆菌溶液混合几分钟后，利用磁场将MNPs/E.coli聚集体分离。去掉上清，聚集体彻底清洗，用荧光染料染色，移至载玻片，拍照。荧光显微镜成像显示大肠杆菌被检测出，检测限达104CFU/mL。

与金属NPs类似，金属纳米壳也有表面等离子供体带。金属纳米壳薄薄的涂在作为核心的大颗粒上。KALELE S A等[34]发现了一种快速可靠检测大肠杆菌的方法，利用将与抗体结合的表面等离子供体用于银纳米壳，大肠杆菌与抗体的相互作用特异性高，其他微生物在表面等离子供体中并不会产生变化。用这种方法，利用抗体结合的银纳米壳有助于快速饮用水检测。

3.3 糖类

LI X等[35]用静电积层自组装技术将光学特性的QDs与生物学特性的葡萄糖氧化酶整合入混合薄膜。基于这种纳米复合膜，开发出一种新型葡萄糖检测生物传感器，其利用CdTe QDs/GOx多层膜固定于光学透明基质中。葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成双氧水，其侵蚀QDs产生许多表面物质，导致QDs荧光淬灭。通过检测荧光变化计算样品中葡萄糖浓度。这种生物传感器对葡萄糖选择性好。可通过控制QDs和GOx的层数提高传感器的灵敏性和线性范围。

WEI H等[36]开发了一种利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成双氧水，与Fe3O4MNPs反应，检测葡萄糖含量的光纤生物传感器。45 ℃条件下，在溶于0.2 mol/L pH 4.0的醋酸盐缓冲液中的H2O2存在时，过氧化物酶的底物2,2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）被Fe3O4MNPs氧化。这种检测葡萄糖的比色法利用GOx和Fe3O4MNPs 作为酶制剂，可以得到高灵敏度和特异性好的光纤生物传感器。

麦芽糖是另一种食物检测中的重要糖类物质。SANDROS M G等[37]发明了一种利用单分子蛋白-覆有硒化镉的硫化锌（CdSe@ZnS）纳米颗粒的电子转移淬灭的麦芽糖生物传感器，这种纳米颗粒是由附有钌II（RuII）复合物的蛋白质提供。这种传感器通过麦芽糖引起的构造变化使得钌II-硒化镉（RuII-CdSe）纳米颗粒距离变化，而该距离会改变纳米颗粒散射强度。

4 结束语

纳米生物传感器基于多种生物传感器传导模式和检测原理，使用方便，适合现场应用。由于是纳米级工作，以后有可能发展出可同时筛查多种分析物的设备。然而，在纳米生物传感器有效应用于真正的食品系统前，还有很多科学技术障碍。特别是对于纳米材料（如NPs，NWs，CNTs等）毒性的担心。为了克服这些障碍，需要加快关于在真实样品分析中的干扰物的研究。面对我国食品安全的需要，以及国际绿色贸易壁垒的挑战，仍然还要继续努力，研制、开发灵敏度高、适用性强、简便快捷的检测技术与方法，以保护我国的利益和消费者的健康，同时还应该争取从源头上杜绝食品安全的隐患。

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