婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的研究进展

李贞，杨保伟，夏效东，王新，席美丽

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

0 引言

食品安全作为一个重大的世界性公共卫生问题，其核心目标在于控制食源性疾病，而微生物污染则是引发食品安全问题的重要因素之一。阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）作为一种新近发现的食源性病原菌，特别容易导致婴幼儿，尤其是出生时体重较轻的新生儿感染[1]。新生儿感染该菌可导致脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症，并可引起严重的神经系统后遗症甚至死亡，且死亡率高达50%以上[2]。虽然目前还不能明确定位其宿主和传播途径，但多起新生儿阪崎克罗诺杆菌感染事件基本证实婴幼儿配方粉是该菌主要的感染源[3]。本文从分类、流行状况、检测和分型方法、药敏性以及毒理研究等方面综述了阪崎克罗诺杆菌的研究进展，以期为该菌相关研究提供参考。

1 阪崎克罗诺杆菌分类

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii,C.sakazakii）为肠杆菌科、肠杆菌属的革兰氏阴性无芽孢杆菌。最初C.sakazakii被认为是肠杆菌的生物变型菌，并被命名为“黄色阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）”。直到1980年，Farmer[1]与其合作者基于DNA杂交、生化反应、黄色菌落产物及药敏性等研究结果，建议将该菌更名为E.sakazakii。2008年，Iversen等[2]根据扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphismas，AFLP）、16S rRNA全序列、DNA-DNA杂交遗传特征和Biotype100、Biologe细菌鉴定系统的表型特征等综合分析，提议将阪崎克罗诺杆菌生物群划分为一个新属，即：克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.），该属包括7个种 Cronobacter sakazakii、Cronobacter malonaticus、Cronobacter dublinensis、Cronobacter muyyjensii、Cronobacter turicensis、C.universalis和 C.condimenti[3-4].

2 婴幼儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的污染状况

2.1 国外产品阪崎克罗诺杆菌带染状况

1961年，英国首次报道2例由阪崎克罗诺杆菌引起的脑膜炎病例[5]。随后，在捷克斯洛伐克、美国、法国和加拿大等30多个国家的市售婴幼儿配方粉中均检测到了阪崎克罗诺杆菌[6-10]。1990年，Clark等[8]调查了2起新生儿阪崎克罗诺杆菌感染事件后，发现从病人和配方粉中分离到的阪崎克罗诺杆菌具有共同特征。2001年4月，在美国田纳西州，发现10例感染阪崎克罗诺杆菌的婴儿体内分离到的阪崎克罗诺杆菌与从婴儿食用的已开罐和未开罐配方奶粉中分离到的菌株脉冲场凝胶电泳（Pulse field gel electrophore-sis,PFGE）指纹图谱一致，从而导婴儿配方粉被大范围召回[11]。此后，美国分别于2002年3月和9月，2003年1月多次大规模召回阪崎克罗诺杆菌污染的婴幼儿配方奶粉。在法国，2004年12月，由于可能与阪崎克罗诺杆菌脑膜炎致死病例有关，受污染的婴幼儿配方奶粉（PregestimilTM）引发了全世界范围的大规模召回[12]。在巴西、阿根廷和卢森堡，也有受阪崎克罗诺杆菌污染的婴幼儿配方奶粉被召回的案例[13]。随着一系列因感染阪崎克罗诺杆菌导致疾病和婴幼儿配方粉被大量召回，婴幼儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌的污染问题已经在国外引起广泛关注。尽管国外对食源性致病的安全控制体系已经比较完善，然而，不断出现的食品安全事件仍需引起广大消费者的重视。

2.2 我国产品阪崎克罗诺杆菌带染状况

在我国，刘秀梅等[14]2004年首次报导从87份安徽阜阳劣质婴儿配方奶粉中检出阪崎克罗诺杆菌，检出率为12.6%。随后，黎明等[15]、张欣强等[16]、权玉玲等[17]分别从我国成都市、广州市、甘肃省采集的婴幼儿配方粉中检出阪崎克罗诺杆菌，检出率从4.41%～6.31%不等。戴岚等[18]还从含乳冷饮中检出了阪崎克罗诺杆菌，且阳性率达40%。乳粉是含乳冷饮的重要原料，因此冷饮受阪崎克罗诺杆菌污染与生产原料必定有关。裴晓燕和刘秀梅[19]对我国市售的81个品牌212份婴幼儿配方粉中分离到的阪崎肠杆菌研究表明，不同品牌产品中阪崎克罗诺杆菌的检出率存在显著差异。她们的研究结果与世界粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）的报道一致[20]。目前，国内研究多数集中在婴幼儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌污染的调查，至今未发现因食用乳粉引起的阪崎克罗诺杆菌致病的报道。2004年2月，FAO/WHO[20]在日内瓦召开的婴儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌研讨会上，与会专家提出婴儿配方粉中微量的阪崎克罗诺杆菌污染也能导致感染发生，因此应对婴儿配方粉的加工、制作和灭菌过程以及贮藏和食用等关键控制点进行严格管理，减少阪崎克罗诺杆菌污染机会。

3 阪崎克罗诺杆菌的检测

3.1 生理生化法

阪崎克罗诺杆菌的主要检测方法为定量检验法，即：Most Probable Number（MPN）法和 DFI（Druggan-Forsythe-Iversen）法。MPN法主要依据美国食品药品管理局（U.S.Food and Drug Administration，FDA）推荐的“婴儿配方乳粉中阪崎肠杆菌的分离与计数”检测程序进行。检测时，在无菌条件下称取样品100 g、10 g和1 g各3份，分别稀释成1∶10的溶液，取10 mL溶液到90 mL肠杆菌增殖肉汤中培养或直接取适量增菌液在结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）培养基上划线，36℃培养过夜后挑取疑似菌落划线于大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）平板，25℃培养48～72 h。挑取黄色菌落用API 20E生化鉴定试剂条鉴定，同时进行氧化酶实验[21]。该方法自2002年公布以来，一直被国际上认为是阪崎克罗诺杆菌检测的经典方法[22]，但该检测需要持续7天左右的时间且灵敏度不高。DFI法[23]在MPN法的基础上改进而得。检测时，在阪崎肠杆菌显色平板上涂布0.1 mL肠道菌增菌肉汤（EE）增菌液，于36℃培养24 h，蓝绿色菌落为阪崎克罗诺杆菌疑似菌落。该改良法已被广泛应用，相对经典方法能缩短2 d左右时间，且提高了检测的特异性。

3.2 API 20E生化鉴定法

API 20E（bioMe′rieux,法国）是革兰氏阴性肠道菌鉴定的常用的商品化鉴定试剂条之一,可基于其用传统细菌的生理生化表型特征分析方法获取鉴定结果[24]。耗材种类少，反应速度快。然而,使用该试剂条对细菌可能只能鉴定到属的水平、结果判别时不同操作者因对反应颜色判断存在差异而导致检验结果的不一致性等不足。Cetinkaya等[25]、Gicˇová等[26]、Turcovský等[27]和Pan等[28]利用此法对阪崎克罗诺杆菌进行了生化鉴定。

3.3 分子生物学检测方法

分子生物学的不断发展使一些灵敏度高、特异性强的检测技术可以应用到食品病原菌的检测之中。阪崎克罗诺杆菌的传统检测方法耗时长，操作繁琐，灵敏度不高。分子生物学检测方法克服了传统检测法存在的问题，使得阪崎克罗诺杆菌快速检测技术得以迅速发展。常用方法有PCR法、实时定量PCR、环介导等温扩增技术（LAMP）、探针法等。

3.3.1 PCR法

2003年Keyser等[29]在评估3种上流式厌氧污泥床技术处理葡萄酒酿造厂废水的能力时，首次报道了阪崎克罗诺杆菌的PCR快速检测方法。2004年，Lehenr等[30]发现Keyser等[29]建立的PCR检测系统在特异性上存在较大问题，不能检测到阪崎克罗诺杆菌ATCC51329这一分支，于是根据多株阪崎克罗诺杆菌的16S rRNA测试结果建立了特异性PCR检测系统，并证实了该系统具有良好的特异性和可靠性。

由于单重PCR检测在特异性和灵敏度上均存在一定差别，为了确定最适的阪崎克罗诺杆菌PCR检测方法，Cawthorn等[31]分别对基于16S rRNA、ITS序列和α-葡萄糖苷酶基因等不同片段的6种检测方法进行了比较和评价，发现基于16S RNA基因扩增产物为929 bp的方法最适合阪崎克罗诺杆菌的检测。同时，Ye等[32]比较了基于ompA基因、ITS序列和α-葡萄糖苷酶基因的3种检测方法，结果显示针对α-葡萄糖苷酶基因扩增产物为673 bp的检测方法有最高的特异性和较高的灵敏度。2013年Huang等[33]利用DNA促旋酶B亚基基因设计引物，建立了一种只能用于区别阪崎克罗诺杆菌和都柏林克罗诺杆菌的普通PCR检测方法。

3.3.2 实时定量PCR

Malorny 等[34]和 Kang等[35]先后于2005年和2007年针对阪崎克罗诺杆菌16S rRNA基因的特异序列设计了引物和探针，建立了Taq Man探针检测方法。

2005年Seo和Brackett[36]首次针对阪崎克罗诺杆菌部分大分子合成操纵子rpsU基因3'端和dnaG基因5'端设计探针，建立了实时定量（Real-time Polymerase Chain Reaction，PCR）PCR检测方法。该方法能特异性鉴别阪崎克罗诺杆菌和其他肠杆菌及非肠杆菌科细菌，无需平板接种和生化鉴定，大大节省了时间，被认为是婴儿配方粉中低污染水平阪崎肠杆菌快速、高灵敏度的定性和定量检测方法，并被FDA认定为筛选和确认婴儿配方奶粉中阪崎克罗诺杆菌的官方方法之一。Liu等[37]2006年基于TaqMan和SYBRgreen技术针对16 S～23S rRNA间区序列设计引物，建立了2种实时PCR方法用于检测经多位点序列分型（MLST）和BHI培养后选择性富集的阪崎克罗诺杆菌，结果显示两种方法的准确率达100%。食源性致病菌PCR检测时，假阴性结果会对人的健康构成威胁，而内参排除假阴性使结果真实可靠，一些学者在进行定量PCR时都加入了内参以监测整个PCR体系，但内参的加入会使检测限稍有降低[38]。Cai等[39]利用外膜蛋白基因ompA基因建立了针对克罗诺杆菌属菌株的荧光定量PCR方法，不但可以快速检测克罗诺杆菌属菌株，还能够进行基因分型。

3.3.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是Notomi等[40]于2000年开发的一种新的恒温核酸扩增方法，具有特异性高和等温扩增快速的特点。贺楠等[41]针对阪崎克罗诺杆菌16S rRNA设计LAMP引物，分别扩增了阪崎克罗诺杆菌标准株（ATCC51329和ATCC29544），3株参考株及13种近源菌株，最低检测限可达0.3 pg基因组DNA，灵敏度为普通PCR的1 000倍。胡连霞等[42]、张宏伟等[43]、马寅众等[44]分别以阪崎肠杆菌的ITS序列、16S rRNA及ompA为靶序列，设计特异性引物进行LAMP检测，结果准确且灵敏度高。张霞等[45]以环介导等温技术为基础，建立了新型交叉引物恒温扩增法，既避免了普通LAMP使用肉眼观察沉淀或颜色变化的主观性，且不需要复杂仪器，对快速筛查、不发达地区顺利开展检测具有实际意义。2012年范宏英等[46]针对阪崎克罗诺杆菌建立了LAMP法并与PCR法进行比较，确立了检测限，对36株近源菌进行特异性检测后发现两法均有很好的特异性。2014年周巍等[47]建立了一种检测婴儿配方乳粉中阪崎克罗诺杆菌的解旋酶恒温基因扩增方法，此法特异性强、灵敏性高、耗时短，为快速检测提供了新方法。

3.3.4 探针杂交方法

Almeida等[48]针对阪崎克罗诺杆菌的16S rRNA设计了一条肽核酸（PNA）探针，检测婴幼儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌时具有很好的特异性和灵敏性。德国医药研究公司也针对阪崎克罗诺杆菌16S rRNA设计了一种荧光标记的DNA探针，基于此探针建立了一整套检测及鉴定系统[49]。Lehner等[49]依据Vermicon identification technology（VIT）操作指南对阪崎克罗诺杆菌进行基因探针检测研究，与普通PCR相比，两种检测方法都具有很好的特异性。探针杂交技术不需要提取DNA，检测快捷，但此技术原则上只能检测到活菌体。

基于探针杂交技术的基因芯片具有高通量、操作简便快速、特异性强、敏感性高等优点。Liu等[50]利用基因芯片技术，依据6株阪崎克罗诺杆菌的ITS序列和GenBank序列信息设计探针，对23株阪崎克罗诺杆菌和65株其他菌进行特异性检测，结果未出现假阴性和假阳性。经过选择性富集，灵敏度可达1.3 CFU/100g婴儿配方粉。Wang等[51]基于ITS序列和O抗原聚合酶基因对包括阪崎克罗诺杆菌在内的10种致病菌进行基因芯片检测，灵敏度可达到0.100 ng DNA。

4 分子分型

目前，用于阪崎克罗诺杆菌的分子分型方法有随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD）、核糖体分型（Ribotyping）和PFGE法等[52-54]。近几年，多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）技术成为受研究者关注的细菌分子分型方法。

4.1 PFGE

PFGE是20世纪80年代中期发展起来的用于分离线状DNA大分子的一种电泳技术,是目前公认的最标准、最可靠的病原菌分子分型方法，被誉为“金标准”[55]。PFGE分型方法分辨力高、重复性好，易于标准化，便于不同实验室之间的结果比较。1996年，美国疾病预防控制中心（U.S Centers for Disease Control and Prevention,CDC）制订了各种细菌的PFGE分型标准，建立了覆盖北美、欧洲、亚太等地区的以PFGE技术为核心的细菌分子分型国家电子网络（PulseNet）使各实验室数据沟通交流更加方便。目前，PulseNet在E.coli O157：H7、沙门氏菌、李斯特菌和副溶血弧菌等常见致病菌的分型、监测和疾病预防控制中发挥着重要作用[56-57]。

1999年，Nazarowec-White等对加拿大配方粉和临床样本分离到的18株阪崎克罗诺杆菌进行PFGE和核糖体分型时，从同一食品生产厂家分离到的核糖体指纹图相同的3株菌XbaⅠ酶切PFGE电泳图谱各不相同，但其中2株SpeⅠ酶切图谱相同，SpeⅠ酶切结果的分辨率略低于XbaⅠ，故Nazarowec-White等推荐最好能用1种以上的限制性内切酶消化细菌染色体DNA，以便更好鉴别阪崎克罗诺杆菌[58]。2008年，裴晓燕等[59]首次在国内同时采用XbaⅠ和SpeⅠ两种限制性内切酶对中国2004至2006年分离的阪崎克罗诺杆菌进行PFGE分型研究，发现得到的条带存在不同程度的差异，可用于阪崎克罗诺杆菌流行株的溯源研究。2010年，许龙岩等[60]采用XbaⅠ对部分国内外食品中分离得到的38株阪崎克罗诺杆菌进行PFGE分型，获得了37个型别。柴云雷等[61]对10株来源不同的阪崎克罗诺杆菌进行了PFGE分型，与16S rDNA序列分析后发现PFGE的分型能力明显优于16S rDNA序列分析。周蒂等[62]对2009年-2013年幼儿配方奶粉生产监控过程分离的46株阪崎克罗诺杆菌菌株进行了PFGE分型研究并取得很好的分型结果。

4.2 多位点序列分型技术

多位点序列分型技术（Multilocus Sequence Typing,MLST）是近年来发展速度非常快的分子生物学分型方法，由多位点酶切电泳技术（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）衍生出来，操作简便,数据方便共享，具有很高分辨力,目前已应用于多种细菌的分型和进化分析[63]。虽然阪崎克罗诺杆菌日益受到广泛关注，但国外对其进行MLST分型的研究还为数不多，国内则更少。2009年Baldwin等[64]建立了基于阪崎克罗诺杆菌ATCC BAA-894全基因组7个管家基因atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB和ppsA的克罗诺杆菌MLST分型方法，并指出了ST型与克罗诺杆菌的分离特征和致病性间的相关性。赵冬等[65]对石家庄市售婴幼儿食品和环境中分离的19株阪崎克罗诺杆菌和1株标准株ATCC51329进行MLST分型后得到12个序列型,发现9个新ST型。Joseph和Forsythe[66-67]以及Sonbol等[68]研究表明ST4型阪崎克罗诺杆菌与致病性密切相关，是全球近20年来最为重要的序列型。2012年，Strydom等[69]根据DNA杂交、表型分型、16S rRNA测序和利用7个看家基因的多序列分析方法对克罗诺杆菌属菌株进行了重新分类。Cui等[70]和Pan等[28]对阪崎克罗诺杆菌进行了PFGE和MLST分型，Cui等[71]对来自我国九个省不同来源的151株菌株进行了MLST分型，与PubMLST数据库比对后发现部分从食品和水中分析得到的序列型与之前其他国家报道的临床中的序列型相同。

5 药敏性

1980年，Farmer等[1]采用 Kirby—Bauer法检测了24株阪崎克罗诺杆菌对抗生素的敏感性。1988年Willis和Robinson[72]推荐使用庆大霉素和氨比西林联合治疗作为阪崎脑膜炎治疗的金标准。2002年，Dennison等[73]从1名64岁患者伤口上分离到的阪崎克罗诺杆菌对氨比西林、庆大霉素和头孢噻肟产生抗性，与早期的文献报道相差甚远。由于肠杆菌科细菌能够产生β-内酰胺酶，较易产生针对广谱抗菌素氨苄西林和头孢菌素的耐药性。Block等[74]和Caubilla-Barron等[75]先后于2002年和2007年对来自新生儿和儿童患者的阪崎克罗诺杆菌进行药敏性分析后，表明这些菌株均为β-内酰胺酶阳性。

裴晓燕等[76]、陆峥等[77]、李秀娟等[78]先后在2007-2010年采用纸片扩散法对婴幼儿配方食品或奶粉生产环境的阪崎克罗诺杆菌进行了药敏性测定。此外，相关研究表明婴幼儿配方粉中阪崎克罗诺杆菌的耐药性明显低于临床分离株[76,79]，其原因可能由于配方法中阪崎克罗诺杆菌主要来自环境污染，而临床分离株受临床用药的影响较大，易产生耐药性。由于抗生素的广泛使用和滥用，致使细菌的耐药程度逐渐增强。阪崎克罗诺杆菌从最初发现至今，耐药性逐渐增加，尽管对其采用的治疗方案在不断变化，仍增加了临床治疗的难度。

6 阪崎克罗诺杆菌毒理研究

阪崎克罗诺杆菌是一种条件致病菌，虽然该菌很多致病机制尚待阐明，但对其毒力因子的研究可能成为揭示其致病机理的关键。2003年，Pagotto等[80]首次提出阪崎克罗诺杆菌的毒力因子可能是一类肠毒素样（Enterotoxin-like）化合物，他们使用18株阪崎克罗诺杆菌以腹腔注射和口腔注入两种方式感染乳鼠,108CFU/每鼠剂量时，18株试验株均能在3 d内导致乳鼠死亡。

OmpA是革兰氏阴性细菌中最主要的毒力因子之一。Wu等[81]基于小鼠模型研究表明该蛋白的表达会影响新生小鼠脑膜炎的发生，在100%致死率的小鼠模型中均检测到OmpA，未检测到OmpA的感染小鼠中未发现任何临床致病表现。

脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）也称作细菌内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞外壁中非常重要的结构和功能分子,也是一种非常重要的毒力因子。2007年，Townsend等[82]发现婴儿配方奶粉中含有细菌脂多糖—内毒素（LPS），他将纯化的脂多糖与阪崎克罗诺杆菌一起注射入乳鼠腹腔，能明显提高阪崎克罗诺杆菌穿透血脑屏障的能力，该研究虽未确切表明阪崎克罗诺杆菌产生内毒素，但可以推测阪崎克罗诺杆菌的致病性与细菌内毒素有明显的关联。

生物膜（Biofilm）是微生物细胞与外界环境相互作用的接口。Mange等[83]通过体外组织细胞培养实验观察到阪崎克罗诺杆菌对人类上皮细胞和脑微血管内皮细胞有吸附粘连特性，并形成丛生，表面形成生物保护膜。Kim等[84]研究表明只要有一定营养液和适宜温度，阪崎克罗诺杆菌就可以在不锈钢管、玻璃管及PVC塑料管腔内壁内吸附生存，并形成生物保护膜,抵御消毒剂等的杀伤作用，与Mange等[83]研究结果一致。

7 结束语

阪崎克罗诺杆菌主要通过婴儿配方奶粉传播，能引起严重的新生儿疾患。近年来多起与之相关的食品安全事件已引起了FAO/WHO及各国的高度重视。目前，国内外报道最多的是食品安全问题，但对阪崎克罗诺杆菌的流行状况、检测方法、分型方法、耐药及毒理研究尚缺少系统的总结归纳。本文对目前阪崎克罗诺杆菌以上相关领域的研究进行了综述，以期为深入研究阪崎克罗诺杆菌提供参考。

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