水溶性膳食纤维促进肠道益生菌生长的研究

杜亚军

（山西省农业科学院农产品加工研究所,太原030031）

0 引言

人体肠道菌群的微生态平衡与健康密切相关，肠道菌群包括益生菌和潜在致病菌[1]。人体肠道益生菌的数量随年龄增大而逐渐减少，益生菌活菌制剂保存性差，活菌摄入机体后在肠道中难以定植，补充益生菌的效果降低，采用促进益生菌增殖的物质来提高体内益生菌将是一条更易被接受的途径[2]。近年来人们的注意力逐渐从生产益生菌活菌制剂向益生菌增殖因子的研究生产转移[3]。

水溶性膳食纤维选择性地刺激益生菌的生长和活力，从而使益生菌增殖[4]。本项目研究低聚糖等多种水溶性膳食纤维对肠道益生菌选择性促进生长作用，探讨水溶性膳食纤维在调节人体微生态环境，提高免疫力、抗氧化、延缓衰老方面的保健功效。

1 实验

1.1 仪器与设备

无菌工作台，YXQG02型电热式蒸汽消毒锅，HG101-2型电热鼓风干燥箱，HG303-3型电热恒温培养箱，HZS-HA水浴振荡器，DZKW型电子恒温水浴锅，

CJJ-78型磁力电热搅拌器，721型分光光度计，PHS-3C型精密pH计，BS110S电子分析天平。

1.1 水溶性膳食纤维原料及其培养液的制备

低聚异麦芽糖（Isomaltooligosaccharid），燕麦β-葡聚糖（Oat branβ-glucan,实验室自制），瓜尔豆胶（Guar gan）,亚麻籽胶（Linseed gun）,果胶（Pectin）,甜菊糖（Stevioside）， 聚葡糖（Pdgdextrosel）。

水溶性膳食纤维培养液的制备：将各水溶性膳食纤维用蒸馏水溶解后配成一定浓度的溶液备用。

1.2 培养基

采用MRS培养基为双歧杆菌增殖培养基（配方见表1）[5]，MRS＃培养基为嗜酸乳杆菌增殖培养基；LB培养基为大肠杆菌增殖培养基。MRS＃培养基：在MRS培养基中添加了促进生长物质碳酸钙质量浓度20 g/L，其中葡萄糖质量浓度为7.5 g/L。双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的鉴别培养基为改良MRS固体培养基[6]，大肠杆菌的鉴别培养基为EMB固体培养基。改良MRS培养基：在MRS培养基中添加了X-Gal（Amresco 0428）0.06 g/L（质量浓度）。

1.3 方法

1.3.1 菌体生长量的测定

增殖液生长量的测定采用浊度法,用分光光度计测定菌液的OD值，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌测定增殖液在660 nm的OD值，大肠杆菌测定增殖液在600 nm的OD值。

表1 MRS、MRS＃培养基组分 g·L-1

1.3.2 菌液PH值的测定

用PHS-3C型精密pH计在室温下测定pH值。

1.3.3 计数方法

采用平板计数法。用无菌水将样品稀释至一定稀释度，涂布平板，每个样品涂布3个平板，培养后进行菌落计数。

每毫升培养液中的菌数=3个平板培养基菌落总数/3×10×培养液的稀释倍数。

1.4 菌种及菌种的活化

两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）冻干菌种，由中国科学院微生物所引入。嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）冻干菌种，菌号ATCC6075,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买。大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）试管斜面菌种，由山西大学资源与环境学院引入。

2 结果与分析

2.1 各种水溶性膳食纤维对肠道菌群生长的影响

分别以质量分数为0.75%的低聚糖、瓜尔豆胶、燕麦β-葡聚糖、亚麻籽胶、果胶、甜菊糖、和聚葡糖取代培养基葡萄糖，作为唯一的培养基碳源，不加水溶性膳食纤维和葡萄糖的相同培养基作为对照，样品和对照进行接种培养。在MRS培养基中以质量分数为5%的接种量接种双歧杆菌，37℃静置培养16 h后测定双歧杆菌的生长量和pH值。在MRS＃培养基中以质量分数为5%的接种量接种嗜酸乳杆菌，37℃静置培养16 h后测定嗜酸乳杆菌的生长量和pH值。在LB培养基中以1%的接种量接种大肠杆菌，37℃水浴震荡培养12 h后测定大肠杆菌的生长量。结果表明，7种水溶性膳食纤维都对双歧杆菌和嗜酸乳杆菌都有显著的促进生长作用，各种水溶性膳食纤维液的促进生长作用显著性大小不同，作为培养基的唯一碳源，水溶性膳食纤维液浓度为0.75%时，对双歧杆菌的促生长作用显著性大小排序如下：瓜尔豆胶＞亚麻籽胶＞燕麦β-葡聚糖＞果胶＞甜菊糖＞低聚异麦芽糖＞聚葡糖，双歧杆菌的生长量是对照的5.48～2.36倍。对嗜酸乳杆菌的促生长作用显著性大小排序如下：果胶＞瓜尔豆胶＞亚麻籽胶＞低聚异麦芽糖＞燕麦β-葡聚糖＞聚葡糖＞甜菊糖，嗜酸乳杆菌的生长量是对照的3.79～1.61倍。除了添加燕麦β-葡聚糖、低聚异麦芽糖和聚葡糖的培养基，大肠杆菌生长量略有增加外（分别是对照的1.53倍、1.38倍和1.22倍），其它水溶性膳食纤维培养基中大肠杆菌生长量与对照相比没有增加，水溶性膳食纤维对大肠杆菌没有促生长作用。各种水溶性膳食纤维对肠道菌群生长的影响如表2所示。

2.2 水溶性膳食纤维对肠道菌群生长的影响

2.2.1 对双歧杆菌生长的影响

实验一：以质量分数为0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7种水溶性膳食纤维分别取代MRS培养基中葡萄糖，作为培养基的唯一碳源进行实验；实验二：在MRS培养基中直接加入质量分数为0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7种水溶性膳食纤维液进行实验（培养基碳源为葡萄糖和水溶性膳食纤维）。以上培养基接入5%的双歧杆菌，37℃静置培养16 h后测定其生长量和pH值。结果表明，培养基中不论是否含葡萄糖，在一定质量分数范围内，随着水溶性膳食纤维液浓度的增加，双歧杆菌生长量也显著增加，而pH值在逐渐减少。当培养基碳源为葡萄糖和水溶性膳食纤维时（实验二），由于葡萄糖也可促进双歧杆菌的生长，水溶性膳食纤维和葡萄糖对双歧杆菌的促生长作用互相叠加，随着水溶性膳食纤维液浓度的增加，双歧杆菌生长量增加不如培养基碳源为葡萄糖实验（实验一）明显，在水溶性膳食纤维液达到一定浓度时，随质量分数的增加，对双歧杆菌的促生长作用不再增加（如低聚异麦芽糖和聚葡糖）。水溶性膳食纤维质量分数对双歧杆菌生长的影响如表3和表4所示。

表2 各种水溶性膳食纤维对肠道菌群生长的影响

2.2.2 水溶性膳食纤维浓度对嗜酸乳杆菌生长的影响

实验一：以质量分数为0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7种水溶性膳食纤维分别取代MRS＃培养基的葡萄糖，作为培养基的唯一碳源进行实验；实验二：在MRS＃培养基中直接加入质量分数为0%，.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7种水溶性膳食纤维液进行实验（培养基碳源为2%葡萄糖和水溶性膳食纤维）；以上培养基接入5%的嗜酸乳杆菌，37℃静置培养16 h后测定其生长量和pH值。结果表明，培养基中不论是否含葡萄糖，在一定浓度范围内，随着水溶性膳食纤维液浓度的增加，嗜酸乳杆菌生长量也显著增加，而pH值在逐渐减少。当培养基碳源为葡萄糖和水溶性膳食纤维时（实验二），由于葡萄糖也可促进嗜酸乳杆菌的生长，水溶性膳食纤维和葡萄糖对嗜酸乳杆菌的促生长作用互相叠加，随着水溶性膳食纤维液质量分数的增加，嗜酸乳杆菌生长量增加不如培养基碳源为葡萄糖实验（实验一）明显，在水溶性膳食纤维液达到一定质量分数时，随质量分数的增加，对嗜酸乳杆菌的促生长作用不再增加（如甜菊糖）。水溶性膳食纤维质量分数对嗜酸乳杆菌生长的影响如表5和表6所示。

2.2.3 水溶性膳食纤维质量分数对大肠杆菌生长的影响

在LB培养基中分别加入质量分数为0%，0.25%，0.5%，0.75%，1.0%，1.5%的7种水溶性膳食纤维，接入1%大肠杆菌，37℃水浴震荡培养12 h后测定其生长量。结果表明，随浓度的增加，水溶性膳食纤维对大肠杆菌生长影响较小，生长量增加不明显，水溶性膳食纤维随浓度增加，对大肠杆菌没有促生长作用。水溶性膳食纤维质量分数对大肠杆菌生长的影响如表7所示。

2.3 体外竞争试验

将3种不同的肠道细菌菌株按同样比例接种于同一瓶分别以7种水溶性膳食纤维为唯一碳源的MRS液体培养基中,混合培养16 h后取样,分别测定益生菌和大肠杆菌的菌落数。有益菌的计数：样品涂布改良MRS平板后，37℃恒温培养48 h，菌落计数。双歧杆菌菌落为深蓝色，菌落呈现圆型，较致密。嗜酸乳杆菌菌落为浅蓝色，菌落扁平状，边缘不整齐，不透明。大肠杆菌的计数：样品涂布EMB平板后，37℃恒温培养24 h，选择具有金属光泽的紫黑色菌落计数。

结果表明，益生菌在生长中占绝对优势，水溶性膳食纤维液浓度为0.75%时，7种水溶性膳食纤维培养液中，益生菌的菌落数都显著高于大肠杆菌菌落数（见图6），益生菌的菌落数比大肠杆菌高出103.57到101.59 mL-1（见表8），这说明水溶性膳食纤维可选择性促进益生菌生长,益生菌的增殖又可对大肠杆菌的生长起一定的抑制作用。肠道益生菌和大肠杆菌混合培养各菌的活菌数如表8和图1所示。

3 讨论

体外实验结果显示：无论是作为培养基唯一的碳源或添加到含葡萄糖的培养基中，7种水溶性膳食纤维都对双歧杆菌或嗜酸乳杆菌有显著促进生长作用，葡萄糖也可促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的生长，但葡萄糖到达结肠前，已大都被小肠吸收，不会被肠道益生菌所利用。7种水溶性膳食纤维对大肠杆菌没有促生长作用。竞争试验结果显示：7种水溶性膳食纤维可显著地促进双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的生长，而双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的增殖又可对大肠杆菌的生长产生一定抑制作用。

表3 水溶性膳食纤维浓度对双歧杆菌生长的影响

表4 水溶性膳食纤维浓度对双歧杆菌生长的影响

表5 水溶性膳食纤维质量分数对嗜酸乳杆菌生长影响

表6 水溶性膳食纤维质量分数对嗜酸乳杆菌生长的影响

表7 水溶性膳食纤维质量分数对大肠杆菌生长的影响

表8 肠道益生菌和大肠杆菌混合培养各菌的活菌数（对数值）

图1 混合培养各菌的活菌数（对数值）

水溶性膳食纤维进入人体消化道后，由于缺少相关消化酶不能被吸收，几乎未受影响直接进入大肠。在大肠内，益生菌通过分泌到胞外的糖苷酶将其降解，然后再吸收利用，这样水溶性膳食纤维可作为益生菌的碳源，选择性地刺激益生菌的生长和活力，从而使益生菌增殖，而大肠杆菌对其不能利用或利用率很低。另一方面，水溶性膳食纤维作为益生菌发酵的底物，可以产生短链脂肪酸，双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在自身的代谢中也会产生乳酸等，这会使得肠道的pH值降低，肠道的酸性环境具有较强的抑菌和杀菌作用，能够控制病原菌的生长和繁殖。乳酸菌等在肠道产生的有机酸及细菌素，也可抑制大肠杆菌和腐败细菌的生长。

总之，水溶性膳食纤维促使益生菌大量增殖，形成微生态竞争优势，产生拮抗物质，直接抑制了外源性和肠内固有腐败菌的生长繁殖，从而有益于发挥正常肠道菌在屏蔽、营养、免疫上的正常功能，是一种良好的益生菌增殖因子。

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