配对t检验法评价3种因素对乳酸菌总数检测结果的影响

黄宝莹，佘之蕴，刘海卿，林耀文，罗湘蓉，黄玲玲

（广东产品质量监督检验研究院，广东顺德528000）

0 引言

乳酸菌是一类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，被广泛地应用于发酵制品和生物制品领域。乳酸菌因具有健胃整肠[1]、抗肿瘤[2]、降低胆固醇、减少过敏反应[3]、抗氧化活性[4]等多种保健功能而备受消费者喜爱。按照《GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》（GB法）[5]要求，乳酸菌数不得低于106mL-1。本文主要研究三种因素对GB法中的乳酸菌总数检测方法的影响，评价不同培养基、含氧量和接种方法检测结果的一致性、等价性或可交换性，以期为日常检测和科研工作提供参考。

1 实验

1.1 培养基

MRS琼脂，TPY琼脂，BBL琼脂。

1.2 仪器与设备

CL-40M高压灭菌锅；GHP-9160隔水式恒温培养箱；AC2-6S1生物安全柜；玻璃热珠灭菌器；Easymix拍击式均质器；dilumat S电子稀释器；AnaeroPack厌氧培养罐。

2 方法

2.1 乳酸菌总数检测

参照GB 4789.35-2010（GB法）对乳酸菌总数进行测定。对发酵乳样进行10倍系列稀释，选择适宜的2-3个梯度，每个稀释度吸取0.1 mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板上进行涂布，并于（36±1）℃，厌氧培养48 h±2 h后计数平板上的所有菌落数。

2.2 不同培养基对乳酸菌总数检测结果的影响

对同一个发酵乳样品，分别用MRS、TPY和BBL培养基检测乳酸菌总数，重复十次，操作步骤按2.1进行，运用SPSS软件采用配对t检验对比分析，比较其均值是否存在差异[6-7]。

2.3 不同含氧量对乳酸菌总数检测结果的影响

对同一个发酵乳样品，按2.1测定乳酸菌总数，培养条件分别为厌氧（氧气质量分数为0%）、微需氧（氧气质量分数为8%～9%，二氧化碳质量分数为7%～8%）和需氧，重复10次，运用SPSS软件采用配对t检验对比分析，比较其均值是否存在差异。

2.4 不同接种方法对乳酸菌总数检测结果的影响

对同一个发酵乳样品，按2.1测定乳酸菌总数，接种方法分别为倾注法和涂布法，涂布法取样量为0.1 mL，倾注法取样量为1 mL。运用SPSS软件采用配对t检验对比分析，比较其均值是否存在差异。

3 结果与分析

3.1 不同培养基对乳酸菌总数检测结果的影响

分别用MRS，BBL和TPY培养基检测乳酸菌总数，结果如表1所示。表1除倾注法是计数10-6稀释度结果，其他均为10-5稀释度结果。为方便计算和分析，直接对计数结果进行配对t检验，各乳酸菌检测结果均为2次平行实验结果的平均值。表1中GB法即为MRS、厌氧和涂布的结果。MRS培养基的检测结果分别与BBL和TPY是配对的两组数据，运用SPSS软件按照配对t检验进行分析，设临界水平α=0.05，数据分析结果如表2和表3所示。

表1 各因素对乳酸菌总数检测结果的影响

表2 培养基因素基本描述统计量

表3 培养基因素t检验结果

由表2可以看出，MRS，BBL和TPY培养基检测结果的均值分别为202.70，222.20和181.40；标准差分别是19.49957，23.73371和22.90657。标准差MRS＜TPY＜BBL。说明MRS培养基的结果波动性相对小，精密度、再现性较好，有利结果的复现以及适用于实验室之间比对。

表5 含氧量t检验结果

由表3可以看出，MRS与BBL均值之间的差值为-19.50，差值的标准差为29.38348，t值为-2.099，显著性P为0.065＞0.05，说明MRS与BBL的检测结果之间的差异不显著。MRS与TPY均值之间的差值为21.30，差值的标准差为37.10960，t值为1.815，自由度为9，显著性P为0.103＞0.05，说明MRS与TPY的检测结果之间没有显著性差异。

3.2 不同含氧量对乳酸菌总数检测结果的影响

分别在厌氧、微需氧和需氧条件下培养乳酸菌（如表1）。厌氧的检测结果分别与微需氧、需氧是配对的两组数据，运用SPSS软件按照配对t检验进行分析，设临界水平α=0.05，数据分析结果如表4和表5所示。

表4 含氧量基本描述统计量

由表4可以看出，厌氧、微需氧和需氧的检测结果的均值分别为202.70、70.70和4.90；标准差分别是19.49957、19.81049和2.37814。从均值就可以直接看出含氧量对检测结果影响非常大。检测样品中含有乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus.bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）四种菌株。各种乳酸菌或益生菌因普遍缺乏好氧的呼吸链（或电子传递链）酶系，以发酵方式获取能量，故在与游离氧的关系上，大多数是一些耐氧性厌氧菌、微好氧菌、兼性厌氧菌或专性厌氧菌。多数耐氧性厌氧菌中存在SOD和过氧化氢酶，可使高毒性的O2-变成毒性稍低的H2O2，进一步还原成无毒的H2O。一些严格的厌氧菌既无SOD又缺乏过氧化氢酶或过氧化物酶，故细胞在有氧环境下形成的O2-极易杀死自己，这就是厌氧菌对氧的高度敏感性或氧对它们毒害的主要原因[8]。

由表5可以看出，厌氧与微需氧均值之间的差值为132.00，差值的标准差为28.11880，t值为14.845，显著性P为0.000＜0.01，说明厌氧与微需氧的检测结果之间的差异非常显著。厌氧与需氧均值之间的差值为197.80，差值的标准差为19.24578，t值为32.501，显著性P为0.000＜0.01，说明厌氧和需氧的检测结果之间也是存在非常显著的差异。

3.3 不同接种方法对乳酸菌总数检测结果的影响

分别采用倾注法和涂布法进行接种，结果如表1所示。涂布法检测结果与倾注法是配对的两组数据，运用SPSS软件按照配对t检验进行分析，设临界水平α=0.05，数据分析结果如表6和表7所示。

表6 接种方法基本描述统计量

表7 接种方法t检验结果

表6结果显示，涂布法和倾注法所得结果的均值分别为202.70和198.30；标准差分别是19.49957和16.09037。倾注法标准差小于涂布法。说明倾注法的结果波动性相对小。

由表7可以看出，涂布和倾注均值之间的差值为4.40，差值的标准差为21.10398，t值为0.659，显著性P为0.526＞0.05，说明涂布和倾注的检测结果之间的差异不显著。倾注和涂布方法得到的乳酸菌总数基本一致，只是倾注法乳酸菌的菌落较小，较难观察，而涂布法得到的菌落分布均匀，直径较大，便于计数。

4 结束语

（1）研究结果发现，使用MRS，BBL，TPY培养基检测乳酸菌总数所得结果在统计学上无显著差异，检测结果具有一致性。乳酸菌在MRS，BBL，TPY培养基上菌落形态也十分相似：乳黄色，直径1～2 mm，圆形。这是由其营养、代谢等生理特性决定的。

（2）微需氧和需氧培养条件的乳酸菌总数检测结果，与厌氧相比，都存在非常显著的差异，说明含氧量对乳酸菌的生长繁殖产生很大的影响。不同品牌的酸奶本身含有的菌种类型不同，因而含氧量对不同样品的乳酸菌总数影响很大。

（3）涂布法和倾注法所得检测结果并无显著性差异。两种接种方法各有优缺点。涂布法的优点是菌落生长在表面，形态均匀，便于计数；缺点是取样量小（0.1 mL）使得结果的标准差较大，平板不干燥或涂布不均匀反而影响计数，操作步骤也较为繁琐。倾注法的优点是取样量大（1 mL）使得结果波动性较小，操作简单；缺点是乳酸菌在培养基内部生长时菌落较小，不利于观察菌落形态和计数。综上所述，在检测过程中，两种接种方法具有可交换性。

[1]王曦,许晓燕,余梦瑶,等.乳酸菌的保健功能及其作用机制研究进展[J].中国乳品工业,2010（9）：38-41.

[2]OHASHI Y,NAKAI S,TSUKAMOTO T,et al.Habitual Intake of Lactic Acid Bacteria and Risk Reduction of Bladder Cancer[J].Urol Int,2002,68（4）：273-280.

[3]NORY K,CHAMBERS S J,PN C,et al O ral delivery of Lacbbacillus casei Shirota modifies allergen-induced immune responses in allergic rhinitis[J].Clin Exp Allergy,2008,38（8）：1282-1289.

[4]VERENA J K,BRIGITTE MARIAN,REINHARD STIDL,et al.Impact of Lactic Acid Bacteria on Oxidative DNA Damage in Human Derived Colon Cells[J].Food and Chemical Toxicology,2008,46：1221-1229.

[5]中华人民共和国卫生部.GB 19302—2010食品安全国家标准发酵乳[S].北京：中国标准出版社,2010.

[6]张文彤.SPSS11统计分析教程（基础篇）[M].北京：北京希望电子出版社,2002：223-229.

[7]刘庆武,张小清,罗玉玲,等.如何用SPSS、SAS进行t检验的运算[J].湘南学院学报,2004,04：49-51.

[8]熊德鑫,刘秉阳.氧气对厌氧菌的毒性作用机理[J].国外医学：微生物学分册,1983,01：6-8.