蚯蚓提取物对动物创伤愈合作用的研究进展

殷建建，胡 群，易子晴，刘 洋，易 丹，李文平

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙410128）

蚯蚓作为一种中药材，在我国应用已经有几千年历史，据《本草纲目》记载: 蚯蚓能治疗瘰疬溃烂、口舌糜疮，临床上常用来治疗骨折、创伤、下肢溃烂等疾病[1]。蚯蚓中含高度不饱和脂肪酸、核苷酸、酶类、蛋白质、蚯蚓解热碱等多种物质，具有清热定惊、止咳平喘、活血通络、降压、抗溃疡、抗肝纤维化、利尿等功能。此外，现代分离技术发现，蚯蚓中还含有纤溶酶、抗菌肽、多种抗氧化酶等活性成分，因此具有止血镇痛、促进创伤愈合、抗氧化、抗血栓、调节免疫、抗心律失常、抗癌等作用[2]。近几年蚯蚓药用价值越来越受到重视，临床研究和应用也日益广泛。国内外对蚯蚓创伤愈合作用的研究成为蚯蚓有效成分分离提纯的新热门。

目前，治疗创伤的药物主要以生物化学制剂内服和中药外敷为主。生物化学制剂对用药者易产生药物的依赖性和耐药性,中药可以有效缩短创面愈合时间、降低瘢痕发生率、安全毒副作用小等。中药治疗创伤应用于临床显得尤为重要，因此，当前大量的研究人员研究蚯蚓提取物，为研发一种成分明确、药效显著、安全无毒副作用治疗创伤的新型制剂而努力。本文对近年来蚯蚓提取物在治疗动物创伤愈合作用的有效成分、分离纯化、药理作用和临床研究进展等方面进行综述，旨在为研发新型创伤类药物提供前瞻性依据。

1 蚯蚓创伤愈合的有效成分及分离

1.1 抗菌肽 抗菌肽是生物免疫系统对抗自然界常在细菌等微生物侵袭的一种基本防御系统，具有广谱的抗菌活性，对细菌、真菌等均具有一定作用，甚至对原虫、病毒和肿瘤细胞也有作用。蚯蚓不仅具有大分子量的抗菌蛋白，而且具有抗菌活性的小分子多肽，且抗菌效果强，毒副作用小。对于蚯蚓抗菌肽的分离提纯方法，目前主要采用层析和电泳技术两种方法。

刘艳琴等采用硫酸铵沉淀—超滤—离子交换层析—Sephadex 凝胶过滤和C18 反相高压液相等步骤从蚯蚓体腔液中分离纯化出多种抗菌肽。Chao 等采用肝素亲和层析和反相C18-HPLC 技术，从粉正蚓中分离、纯化出一种新的抗微生物肽类，命名为lubricin。该成分为含脯氨酸的62 氨基酸肽类，cDNA 序列分析证明其为一种76 氨基酸的前体形式。张希春等通过硫酸铵沉淀、超滤和阳离子交换分离从蚯蚓匀浆液中得到了两种新的抗菌肽F-1 和F-2。F-1 和F-2 的精确分子量分别为535.27 Da 和519.27 Da。孙振钧通过超滤分离、分子筛柱层析、离子交换柱层析-脱盐等步骤，从蚯蚓匀浆液中初步分离纯化出一种抗菌四十肽。王庄[3-5]等通过电击诱导蚯蚓产生抗菌肽、超滤浓缩脱盐以及截取3～30 kD 的抗菌肽、阳离子交换、凝胶过滤层析分离提纯得到3～30 kD 的蚯蚓抗菌肽。

1.2 抗氧化系成分 通常把具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基功效的生物活性肽称为抗氧化活性肽（简称抗氧化肽）。蚯蚓提取物抗氧化作用主要是通过提高机体SOD、GSHPx、CAT 等体内抗氧化酶系的活性完成[6]，被临床证明具有良好的抗氧化、对抗炎症损伤的作用。

廖怡[7]等采用闪式提取技术，从蚯蚓体内提取出SOD、CAT，并通过羧甲基纤维素CM-22 离子交换层析实现SOD 和CAT 的联合提取分离，并且在纯化工艺中经过丙酮沉淀和柱层析技术得到蚯蚓SOD 纯品。商桂娜[8]等利用较超声波提取法、组织匀浆法和闪式提取法3 种方法都提取得到了蚯蚓GSH-Px。周亿金[9]等通过构建超氧阴离子自由基和羟基自由基体系以及脂蛋白多不饱和脂肪酸(PUFA)过氧化体系,测定蚯蚓抗氧化提取物在邻苯三酚自氧化体系中对超氧阴离子自由基、Fenton 反应体系中对羟基自由基的清除作用及脂蛋白PUFA 过氧化体系中对脂质体的抗氧化作用。Mariappan BALAMURUGAN[10]等利用Lampito mauritii 蚯蚓提取液对大鼠保护肝脏和抗氧化能力的试验模型，通过生化检测肝脏GSH，SOD，GPx，CAT 等含量变化情况，证实水蛭蚯蚓提取液有增强肝组织的抗氧化能力。

1.3 纤溶酶 蚯蚓纤溶酶是从蚯蚓中分离的一种丝氨酸蛋白水解酶，具有直接溶解纤维蛋白的纤溶酶活性，又具有类尿激酶的纤溶酶原激活活性，是治疗和预防血栓疾病的有效药物。目前国内外学者研究表明，蚯蚓纤溶酶具有抗凝血、溶血栓、抗炎、抗肿瘤、神经修复等作用，尤其是溶栓作用，已经成为现代临床研究的热门[11]。

目前纤溶酶的分离纯化技术也较为成熟，一般分离步骤为:制备蚯蚓匀浆、盐析（超滤分级）、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱或快速蛋白液相色谱法纯化、电泳。

何执中等用PB 液抽提、硫酸铵盐析及凝胶过滤层析、离子交换层析等方法，分别从蚯蚓体腔液中分离得到分子质量在29～36 ku 的纤溶活性组分，分子质量为30 ku。陈美凤等采用Sephadex G-100 及DEAE-52 离子交换纤维素两种柱子进行分离纯化，得到比活为7 000 mg/mL 的纤溶酶。Li L 等用加入了氨基比林酸的合成树脂来分离蚯蚓组织匀浆中的糖基化组分，在用SDS-PAGE 法证明所分离组分的成分均一性后，采用质谱法分析证明其分子质量为34.193 kD。张汶婕[12]等采用超滤膜分级分离及DEAE-Sepharose fast flow 离子交换层析及Sephadex G-75 凝胶层析，从小于20 kD 废液中分离出两种电泳纯蚯蚓纤溶酶同工酶。

1.4 镇痛有效成分 临床实践表明，蚯蚓具有良好的创伤镇痛，促进伤口愈合的作用。目前蚯蚓及其提取物已应用于创伤、烫伤、烧伤、褥疮等方面的治疗。

崔泓等利用硫酸铵分段盐析，DEAE 纤维素-DE52 离子交换层析，Sephadex-G100 凝胶层析技术分离到分子量为87000、72000、57000 的3 种蛋白质，临床发现蚯蚓液能缩短炎症周期，其良好的抗炎能力与巨噬细胞的活化有关。随后李冬实验研究又表明，利用80 mg/L 浓度的氯化镉（Cd-Cl2）溶液对蚯蚓进行诱导，再利用结合有Cu2+的金属鳌合亲和层析柱对粗提蛋白液进行初步分离，对分离液进行SDS-PAGE，再使用电泳洗脱纯化，并对纯化样品的分子量和紫外吸收峰对其相应的理化性质进行鉴定，分离提纯了分子量为14.4 kD 的金属硫蛋白。

2 蚯蚓提取物对创伤愈合的作用机理

2.1 止血及解热镇痛作用 蚯蚓在中草药中常被用作治血化瘀药物，同时它还具有明显的解热镇痛效果，但其解热镇痛作用机理尚不明确，可能与其具有的抗菌肽、镇痛、抗氧化、改变血液流变等功效的多种活性物质共同作用相关。

段平等把低剂量的蚯蚓纤溶酶用于大鼠体内，能使得大鼠纤维蛋白原（Fbg）平均下降45%，凝血酶时间（TT）由11.13 s 延长到22.63 s（P＜0.01）。高剂量的溶栓酶除能明显降低Fbg 和延长TT 外，可使凝血酶原时间（PT）由16.82 s 延长到73.44 s，白陶土部分凝血活酶时间（KPTT）由46.63 s 延长到124.13 s，并能使Ⅱ、Ⅷ因子降解，起到很强的抗凝效果。何执中等试验表明蚯蚓纤溶酶可以直接降解纤维蛋白和纤维蛋白原，还可以通过激活纤溶酶原而发挥间接作用。此外，蚯蚓纤溶酶可抑制血小板聚集，促使血管内皮细胞分泌t-PA、水解凝血酶。陈学东等利用口服地龙煎液方法，观察其出血时间和凝血时间表明，地龙煎液组出血、凝血时间与空白组、生理盐水组比较均有显著差异（P＜0.01），说明在24 h 内连续服用2 次地龙煎液后,可以使人的出血、凝血时间明显延长。

朱道辰等的研究表明，蚯蚓乙醇粗提物连续灌胃2 d，能显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀，与空白对照组相比具有显著差异（P＜0.05）。陈斌艳通过试验研究发现，蚯蚓粉剂具有明显的镇痛作用，但与扑热息痛并没有协同作用。

2.2 抗菌消炎及抗氧化作用 蚯蚓对于抗菌、消炎方面的作用，主要通过蚯蚓体内所含有的抗菌肽和抗氧化系成分来完成。

代萌等利用动物模型，用蚯蚓纤溶酶凝胶剂对大鼠足跖肿胀和小鼠耳肿胀进行试验测定，结果发现蚯蚓纤溶酶具有明显的抗炎效果，而且其抗炎效果相当于5%氢化考的松[13]。李曾夏子[3]等证实，从蚯蚓体内分离提纯出的3～30 kD 抗菌肽对兔巴氏杆菌具有良好的防治效果，可以有效地在菌体表面产生空泡，抑制细菌生长，杀死细菌。Pan 等利用比色法测定蚯蚓体腔液对大肠杆菌、假单胞铜绿菌、嗜水产气单胞菌3 种革兰阴性菌和金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、节杆菌3 种革兰阳性菌都具有明显的抑制作用。

武金霞[14]等以邻苯三酚自氧化体系检测不同浓度蚯蚓冻干粉浸提物（EELP）对超氧阴离子的清除作用，以Fenton 反应体系检测其不同浓度下抑制羟基自由基产生的能力，证实一定浓度的EELP 具有一定抗氧化作用。周亿金[9]等通过对成年小鼠按时定量地灌喂蚯蚓抗氧化提取物,测定其血液和肝脏抗氧化酶活性及丙二醛（MDA）含量，检测蚯蚓抗氧化提取物在成年小鼠体内的抗氧化能力试验表明，不同浓度的蚯蚓抗氧化提取物对成年小鼠血液及肝脏的SOD、CAT、GSH -Px活性的升高和MDA 含量的减少均有不同程度的影响，并且以10 倍稀释的蚯蚓抗氧化提取物影响最显著（P＜0.05），能有效降低小鼠体内的脂质过氧化水平并且防止体内抗氧化酶受自由基诱导的氧化损伤, 提高抗氧化酶的活性。Zhang[15]等用两种不同浓度（5%、10%）的蚯蚓萃取液分别施加于Wistar 大鼠烫伤处表明，氧的消耗量和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性降低，烫伤后席夫碱含量增加。

2.3 促进创伤愈合作用 张凤春等在新西兰大白兔背部伤口模型上用药，试验组在伤口上滴0.2 mL蚯蚓提取液，对照组在伤口上滴同量的0.02 mol/L pH 值为7.4 的磷酸缓冲液（PBS），于伤后5、7、10、14 d进行肉眼观察，并取肉芽组织，分别做免疫组化ABC染色和电镜观察。分别用bFGF 和PBS 做阳性对照和阴性对照。结果显示，用药组肉芽组织中含大量肌纤维母细胞，合成功能活跃，肌肉组织中肌动蛋白增多，伤口收缩明显，与阴性对照相比有显著性差异，伤口修复较快。吴俊荣[16]等报道，蚯蚓外敷对兔耳瘢痕形成有抑制作用，可以减少创面炎性反应，加速创面愈合，减少瘢痕的形成，并且减少瘢痕组织中成纤维细胞数量以及胶原的含量，减轻瘢痕纤维化程度,使得瘢痕软化、变小，从而达到抑制瘢痕的作用。周莹[17]等以MTT 法测定EFP 对大鼠成纤维细胞（NIH3T3）的促进增殖作用；细胞划痕法测定EFP促进NIH3T3细胞划痕创面愈合作用，MTT分析表明，不同浓度的EFP 都对NIH3T3 细胞都具有增殖作用，且这种促进增殖作用呈现一定的剂量依赖性，不同浓度的EFP 都有促进NIH3T3 细胞划痕创面愈合的作用，且这种促进划痕创面愈合的作用呈现一定的剂量依赖性。

3 蚯蚓提取物对动物创伤的临床应用

随着现代医学和分子生物学的不断进步，蚯蚓越来越多的成分被不断的发掘、研究和应用，如纤溶酶、抗菌肽、纤溶酶原激活剂、乙酰胆碱酯酶、血管收缩素、钙调素等。其中蚯蚓纤溶酶、抗菌肽和抗氧化成分已被制成相应药物，应用于临床。

崔涨等通过试验首先确定了蚯蚓中存在促进成纤维细胞增生的活性物质，并且发现其对成纤维细胞的作用存在量效关系，即在一定浓度范围内随着浓度的增加而作用增强，并有一最适浓度，高于此浓度时其作用降低，同时临床发现蚯蚓液能减少渗出，缩短炎症周期，加速伤口的愈合。

陈云峰对大白兔背部创伤模型的试验研究，得出了蚯蚓能显著加速肉芽组织生成，促进表皮生长，并且能使伤口创缘明显收缩，从而提高伤口的愈合率，使愈合期提前的结论。还有应用其醇提物作用于成纤维细胞，表明适当浓度的蚯蚓醇提液具有促进成纤维细胞生长的作用，高浓度时增殖下降。

章梅等采用大鼠深Ⅱ度烫伤模型，创面应用蚯蚓提取物软膏、类肝素软膏，观察其对大鼠深Ⅱ度烫伤早期创面病理变化和创面愈合的影响，并测定了烧伤创面含水量、血浆和烧伤创面抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ），纤维蛋白降解产物（FDP）含量，烧伤创面羟脯氨酸含量，Ⅰ/Ⅲ型胶原比例，真皮细胞增殖周期及创面愈合时间。试验结果发现，创面外用蚯蚓提取物可以降低烧伤创面水肿程度，增加血浆AT-Ⅲ活性，增加烧伤创面FDP 含量，增加真皮细胞中DNA合成，减轻烧伤创面早期加深，缩短大鼠深Ⅱ度烧伤创面愈合时间。张凤春等在对大鼠背部创伤愈合试验表明，蚯蚓能显著地增加肌肉组织中肌动蛋白数量，有利于伤口的收缩。电镜观察发现蚯蚓组肉芽组织中的细胞生长旺盛。针对这一作用，王沛等对50 例痔结扎注射术的病人进行了临床观察，痔核脱落时局部喷洒蚯蚓组分溶液。结果平均愈合时间明显缩短，表皮生长速度明显加快，表明蚯蚓具有明显的促进创伤愈合的作用。

蚯蚓提取物对烫伤愈合的临床应用虽进行了一些探索，关于蚯蚓组织成分对烫伤愈合作用的研究还处于初级阶段，对烫伤愈合作用机制的研究还不多，其作用特点尚认识不足，这方面的工作还有待加强。

4 小结与展望

蚯蚓资源丰富，提取成本低廉，药理作用明显，生物技术处理后毒副作用小，疗效确切，而且随着国内外对蚯蚓提取物的研究日益深入和广泛，进行蚯蚓产品的研发具有十分广阔的科学前景。但由于蚯蚓体内成分复杂，有些作用机理尚不明确，国内对蚯蚓的研究多集中于纤溶活性成分，一般多为一些小分子肽类及蛋白，对蚯蚓在创伤愈合、镇痛等方面研究较少，导致我国开展蚯蚓药理作用机制研究的步伐明显滞后。同时，创伤愈合也是一个极其复杂的过程，涉及多个层面，尽管人类目前对其认识水平显著提高，但在很多方面仍需深入研究。相信随着生命科学的进步，蚯蚓提取物的作用机制更加清楚、有效成分更加明确、疗效更加显著，使其临床应用更合理、更有效、更广泛。

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