慢性乙肝患者外周血中Th22、Th17细胞及其细胞因子浓度水平的变化与意义

戴小波　薛长山　周文英　黄小燕　唐文志　黄凯晨(珠海高新技术产业开发区人民医院检验科，广东　珠海　59000)

慢性乙肝患者外周血中Th22、Th17细胞及其细胞因子浓度水平的变化与意义

戴小波1薛长山周文英2黄小燕1唐文志1黄凯晨1
(珠海高新技术产业开发区人民医院检验科，广东珠海519000)

〔摘要〕目的探讨辅助T淋巴细胞(Th) 22细胞、Th17细胞及其细胞因子在慢性乙型肝炎患者外周血中的表达及意义。方法选取2013 年6月至2014年3月在我院就诊患者或体检者共101例，其中慢性乙型肝炎患者25例，乙肝病毒携带者21例，非病毒性肝炎35例。另选取同期20例健康体检者为正常对照组。用流式细胞术分别检测各组外周血中Th22细胞、Th17细胞所占比例。用酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测各组外周血中白细胞介素(IL) -22、IL-17的血清浓度。结果与正常对照组比较，慢性乙型肝炎组Th22细胞及IL-22、IL-17明显降低(P＜0.05)，但Th17细胞无统计学差异(P＞0.05) ;与乙肝病毒携带者比较，慢性乙型肝炎组IL-22、IL-17明显降低(P＜0.05)，Th17细胞明显升高(P＜0.05)，但Th22细胞无统计学差异(P＞0.05) ;与非病毒性肝炎组相比，慢性乙型肝炎组Th22、Th17细胞及IL-22、IL-17均明显降低(P＜0.05) ;与正常组比较，乙肝病毒携带者Th22、Th17及IL-17均无统计学差异(P＞0.05)，但IL-22明显降低(P＜0.05)。结论Th22细胞数量减少或功能减退，IL-22浓度降低，使慢性乙型肝炎患者肝细胞失去IL-22的保护作用，是慢性乙型肝炎发病的重要因素;而Th17细胞及IL-17可能未参与慢性乙型肝炎的慢性期炎症。

〔关键词〕慢性乙型肝炎; Th22细胞; Th17细胞;白细胞介素22;白细胞介素17

1广东省中医院珠海医院检验科

2中山大学第五附属医院中心实验室

第一作者:戴小波(1978-)，男，副主任技师，主要从事感染与免疫方面的研究。

研究认为辅助T淋巴细胞(Th)细胞分化失衡是介导慢性乙型肝炎病情变化的主要机制〔1〕，但是失衡的原因还不清楚。Th17、Th22细胞是最近发现的新型Th，Th17细胞及其细胞因子在免疫炎症的早期发挥关键作用，而Th22细胞数量及功能的变化与免疫炎症也关系密切。本研究拟初步探讨Th22、Th17及其细胞因子在慢性乙型肝炎中的变化及意义。

1　材料与方法

1.1研究对象选取2013年6月至2014年3月在我院就诊患者或体检者共101例，其中慢性乙型肝炎患者25例，年龄55～75〔平均(59.6±4.2)〕岁，其中男14例，女11例;乙肝病毒携带者21例，年龄57～76〔平均(61.5±3.9)〕岁，其中男13例，女8例。慢性乙型肝炎及携带者的诊断标准参考《慢性乙型肝炎防治指南(2010)》〔2〕及《病毒性肝炎防治方案(2000)》〔3〕，非病毒性原因造成的肝细胞损伤(非病毒性肝炎) 35例，年龄56 ～74〔平均(60.4±5.9)〕岁，其中男20例，女15例。排除自身免疫性疾病、急性炎症、其他系统慢性炎症，6个月内未接受过免疫抑制剂、抗病毒治疗者。正常对照组为20例健康体检者，年龄15～58岁，其中男12例，女8例，排除各种病毒性肝炎、自身免疫性疾病、皮肤病者。肝功等各项生化指标正常。各组在年龄、性别等方面均具有可比性。

1.2主要试剂及检测方法Th22细胞及Th17细胞检测:检测方法参照参考文献〔4〕，利用Beckman Coulter XL四色流式细胞仪检测Th17细胞、Th22细胞占CD4+T淋巴细胞的比值。试剂来源: CD4(ECD标记)荧光标记抗体由贝克曼公司提供，CCR4 (Percp/cy5.5标记)、CCR6(FITC标记)、CCR10(PE标记)荧光标记抗体由Biolegend公司提供。检测方法:将相应抗体分别加入100 μl EDTA抗凝外周血中，充分混匀，4℃避光反应20 min。在全血样本管中加溶血剂1 ml，混匀避光放置5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，沉淀用200 μl PBS悬浮，上流式细胞仪(BECKMAN COULTER XL)检测。白细胞介素(IL) -22、IL-17测定:用酶联免疫吸附(ELISA)方法检测，检测试剂盒由Bio-swamp公司提供。

1.3统计学方法应用SPSS16.0软件进行t检验、Spearman线性相关分析。

2　结果

2.1Th22细胞及IL-22检测结果与正常对照组〔Th22细胞(2.29±0.014) ％; IL-22(88.3±51.2) pg/ml〕比较，慢性乙型肝炎组Th22细胞〔(0.95±0.015 ) ％〕及IL-22〔(12.8± 25.7) pg/ml〕明显降低(t = 3.004，P = 0.004; t = 6.429，P = 0.000) ;与乙肝病毒携带者〔IL-2(38.8±28.7) pg/ml，Th22细胞(1.73±0.009) ％〕比较，慢性乙型肝炎组IL-22明显降低(t = 3.228，P=0.002)，但Th22细胞无统计学差异(t = 2.020，P = 0.053) ;与非病毒性肝炎组〔Th22细胞(3.11±0.018) ％，IL-22 (168.4±118.9) pg/ml〕比较，慢性乙型肝炎组Th22细胞及IL-22都明显降低(t= 4.764，P= 0.000; t= 6.429，P= 0.000) ;与正常对照组比较，乙肝病毒携带者Th22细胞无统计学差异(t = 1.540，P=0.132)，但IL-22明显降低(t=3.847，P=0.000)。

2.2Th17细胞及IL-17检测结果与正常对照组〔Th17 (1.09±0.012) ％，IL-17(25.4±51.6) pg/ml〕比较，慢性乙型肝炎组IL-17〔(2.4±6.8) pg/ml〕明显降低(t= 2.216，P= 0.032)，但Th17细胞〔(1.87±0.015) ％〕无统计学差异(t = 1.862，P = 0.069) ;与乙肝病毒携带者〔Th17细胞(1.02±0.007) ％，IL-17(23.0±39.7) pg/ml〕比较，慢性乙型肝炎组Th17细胞明显升高(t=2.301，P= 0.026)，而IL-17较携带者明显降低(t = 2.552，P=0.014) ;与非病毒性肝炎组〔Th17细胞(3.55±0.023) ％，IL-17(232.7±365.2) pg/ml〕比较，慢性乙型肝炎组Th17细胞及IL-17均明显降低(t=3.153，P= 0.003; t= 3.144，P= 0.003) ;与正常对照组比较，乙肝病毒携带者Th17细胞及IL-17均无统计学差异(t=0.206，P=0.837; t=0.173，P=0.864)。

2.3Th22、IL-22、Th17、IL-17与ALT的相关性非病毒性肝炎组Th22、IL-22、Th17、IL-17与ALT的相关系数分别为－0.11，－0.04，0.02，0.14;慢性乙型肝炎组Th22细胞比值与ALT呈正相关(r = 0.65，P＜0.05)。Th17、IL-22与ALT的r值分别为0.23，－0.22，－0.29。

3　讨论

Th22细胞是最近在研究银屑病等皮肤炎症过程中发现的不同于Th1、Th2细胞的一类新型Th细胞〔4〕，细胞表面表达CCR6+、CCR4+、CCR10+〔5〕。Th22功能的丧失或数量减少都可以导致慢性炎症疾病恶化，另一方面，Th22细胞数量过多或功能过度活跃也可导致免疫炎症加重〔6〕。Th22细胞主要通过分泌IL-22发挥生物学效应。体外实验表明，IL-22对肝细胞免疫炎性损伤具有保护作用，在对小鼠急性肝损伤模型的研究中发现，IL-22能明显减轻ConA对小鼠的肝损伤〔7〕，IL-22 mRNA以及IL-22在ConA诱导的肝炎中显著高表达，IL-22的中和抗体可以加重肝损伤，给予重组IL-22后可以减轻肝损伤的过程〔8〕;另一方面IL-22还是肝细胞的存活因子，能减轻T细胞介导的肝损伤及抑制肝细胞凋亡〔8〕，这与IL-22能够诱导组织修复途径，以限制组织损伤和过度炎症反应有关;因此IL-22对T细胞介导的免疫性肝损伤具有一定的抑制作用〔9〕，IL-22对肝细胞的保护作用与Th22细胞在数量过多时可能造成免疫损伤学说相矛盾。

Th17细胞表面表达CD4、CCR4、CCR6，其分化路径与Th1、Th2明显不同〔10，11〕，Th1、Th2型细胞因子干扰素(INF) -γ、IL-4都能抑制Th17细胞的分化。Th17细胞主要通过分泌IL-17发挥生物学作用，目前研究认为，Th17细胞及IL-17处于固有免疫及获得性免疫的交界面，能够通过募集和激活中性粒细胞、单核巨噬细胞聚集从而介导早期免疫排斥〔12〕及其他免疫性炎症反应，因此Th17细胞与Th1细胞功能的区别之一是二者作用的时间点不同，Th17细胞产生迅速，在免疫炎症的急性期发挥作用，而Th1细胞则在延长或促进后期免疫炎症反应方面发挥主导作用〔13〕。本研究说明慢性乙型肝炎患者在Th细胞分化过程中，Th22细胞分化及分泌IL-22的功能都受到抑制，导致IL-22及Th22下降，也可以推测IL-22及Th22细胞的减少或功能缺失是慢性乙型肝炎发病的原因之一，另一方面，慢性乙型肝炎患者由于缺乏IL-22对肝细胞的保护与修复作用，导致肝炎反复发作，迁延不愈。上述数据说明，慢性乙型肝炎患者的Th细胞分化偏移，Th22细胞数量减少或功能减退，可能是慢性乙型肝炎肝细胞损伤的原因之一，Th22细胞在慢性乙型肝炎的发病过程中可能未发挥免疫调节作用，而是通过IL-22起到保护肝细胞的作用。

本研究与余雪平等〔14〕研究结果不同，这可能与慢性乙型肝炎患者的病程、发病机制及Th17、Th1细胞分化特征有关，在乙肝的急性期，IL-17可能增多，通过招募与激活中性粒细胞及单核细胞发挥免疫损伤作用，而在乙肝的慢性期，肝细胞损伤主要与Th1型细胞损伤有关，Th1型细胞因子IFN-γ能抑制Th17细胞的分化，课题组收集的标本库主要为慢性乙型肝炎反复发作的患者，都处于慢性期。上述结果也说明，在慢性乙型肝炎反复发作的慢性期，Th17细胞及IL-17轴不是肝细胞损伤的主要原因。

4　参考文献

1汪云，李红霞，冯涛，等.不同病毒载量慢性乙型肝炎患者树突状细胞B7-H1表达及对免疫功能的影响〔J〕．现代生物医学进展，2014; 14(6) : 1029-32，1061.

2中华医学会肝病学会，中华医学会感染病学会.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)〔J〕．肝脏，2011; 16(1) : 2-16.

3中华医学会传染病与寄生虫学分会，中华医学会肝病学分会.病毒性肝炎防治方案〔J〕．中华传染病杂志，2001; 19(1) : 56-62.

4 Trifari S，Kaplan CD，Tran EH，et al．Identification of a human helper T cell population that has abundant p roduction of interleukin 22 and is distinct from Th-17，TH1 and TH2 cells〔J〕．Nat Immunol，2009; 10(8) : 864-71.

5 Duhen T，Geiquer R，Jarrossay D，et al．Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin homing memory T cells〔J〕．Nat Immunol，2009; 10(8) : 857-63.

6 Eyerich S，Eyerich K，Pennino D，et al．Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling〔J〕．J Clin Invest，2009; 119(1) : 3573-85.

7蔡欣，杨永昌，王园园，等.白细胞介素22对T细胞介导的小鼠肝损伤的治疗作用及初步机制探讨〔J〕．中国实验动物学报，2009; 17 (2) : 138-42．

8 Radaeva S，Sun R，Pan HN，et al．Interleukin 22(IL-22) plays a protective role in T cell-mediated murine hepatitis: IL22 is a survival factor for hepatocytes via STAT3 activation〔J〕．Hepatology，2004; 39(5) : 1332-42．

9 Zenewicz LA，Yancopoulos GD，Valenzuela DM.Interleukin-22 but not interleukin-17 provides protection to hepatocytes during acute liver inflammation〔J〕．Immunity，2007; 27(4) : 647-59.

10 Park H，Li Z，Yang XO，et al．A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17〔J〕．Nat Immunol，2005; 6(11) : 1133-41.

11 Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al．Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages〔J〕．Nat Immunol，2005; 6(11) : 1123-32.

12戴小波，孙万邦，张磊，等.重组人IL-10对皮肤移植家兔血清中IL-17家族水平的影响〔J〕．临床检验杂志，2012; 30(5) : 351-4.

13 Korn T，Reddy J，Gao W，et al．Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation〔J〕．Nat Medicine，2007; 13(4) : 423-31.

14余雪平，苏智军，郭如意等.慢性乙型肝炎患者外周血Treg/Th17检测及其意义〔J〕．福建医科大学学报，2012; 46(2) : 123-6.

〔2015-01-20修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目:珠海市卫计局立项项目(2013091)

〔中图分类号〕R512.6+2

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 16-4583-02;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.16.075