RNA干扰K-ras基因对肺腺癌H441细胞EGFR-TKI耐药性的影响

RNA干扰K-ras基因对肺腺癌H441细胞EGFR-TKI耐药性的影响

胡述提金冰林涛

(南阳市中心医院胸外科，河南南阳473000)

摘要〔〕目的探讨RNA干扰K-ras基因对肺腺癌H441细胞株细胞EGFR-TKI耐药性的影响。方法构建靶向K-ras基因的表达载体并转染肺腺癌H441细胞，分别检测转染后细胞中K-ras蛋白及基因表达以及对吉非替尼敏感性的改变。结果实验组中K-ras基因及蛋白的表达量明显低于对照组(P<0.05)；实验组中细胞凋亡率及细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.05)。结论靶向突变K-ras基因的siRNA可以诱导肺腺癌H441细胞凋亡，减弱对吉非替尼的耐药性，为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。

关键词〔〕RNA干扰;肺腺癌;吉非替尼;耐药

中图分类号〔〕R734.2〔文献标识码〕A〔

第一作者：胡述提(1978-)，男，主治医师，硕士，主要从事胸部疾病的临床工作。

应用表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)，已使众多肺癌患者获益。多项临床研究显示，EGFR-TKI治疗肺癌的疗效与肺癌EGFR基因突变有关，而与EGFR蛋白免疫组织化学表达水平高低无明显关系；对突变型基因肺癌，EGFR-TKI治疗的有效率可以高达50%以上，而对野生型基因肺癌的有效率则低于10%〔1〕。K-ras基因是EGFR信号转导通路下游的一个重要节点，该基因的突变可以引起EGFR信号通路的EGFR非依赖性持续性激活，进而导致EGFR-TKI原发性耐药〔2〕。本研究探讨RNA干扰K-ras基因对肺腺癌H441细胞株细胞EGFR-TKI耐药性的影响。

1材料与方法

1.1材料人肺腺癌H441细胞株(突变型K-ras)购自ATCC公司，在含10%胎牛血清的1640培养基中于37℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，每3 d更换1次培养液，用胰酶细胞消化液〔含0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化传代，取对数生长期细胞用于实验；质粒pSilencer3.1购自Ambion公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；兔抗人K-ras、β-actin一抗及羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。四甲基偶氮唑盐(MTT)购于Sigma公司。RPMI 1640培养液及胎牛血清购自美国Gibco公司。吉非替尼(商品名：易瑞沙)由Astra Zeneca公司惠赠。

1.2pSilencer3.1表达载体构建设计63 bp具有互补序列且能够编码shRNA的双链寡核苷酸，正义：5’-GATCCGTTGGAGCTGTTGGCGTAGTTCAAGAGACTACGCCAACAGCTCCAAC TTTTTT11GGAAA-3’，反义:5’-AGCTTTTCCAAAAAAGTTGGAGCTGTTGGCGT-AGTCTCTTGAACTACGCCAACAGCTCCAAC G-3’，其转录产物所形成的siRNA作用靶点为K-ras mRNA 206～225位的核苷酸，第12位密码子由GGT突变为GTT。阴性对照双链寡核苷酸转录产物所形成的siRNA的作用序列为：5’-GGTTCATAAGGCGCTAGC-3’。将上述合成的双链寡核苷酸退火后与pSilencer3.1线性载体定向连接并行核酸测序，命名为pSilencer3.1-K-ras。

1.3质粒转染及细胞分组实验分为阴性对照组、空载体组及实验组。将生长状态良好的H441细胞按1.5×105个/孔接种于24孔板，于37℃、5% CO2恒温培养。次日待细胞70%～80%融合时，每孔均按总量3 μg的质粒载体分别用LipofectaminelTM进行转染，转染后用含G418的培养液筛选出稳定转染的细胞并传代。

1.4RT-PCR方法检测K-ras mRNA 收集稳定转染的细胞，Trizol法提取细胞总RNA。RT-PCR体系中加入两对引物，第一对为内参β-actin基因的引物，正义引物：5’-CTCGCGCTACTCTCTCTTTCTGG-3’，反义引物：5’-GCTRACATGTCTCGATCCCACTRAA-3’，PCR扩增片段为394 bp；第二对是K-ras基因的引物，正义引物：5’-GACTGAATATAAACTTGTGG-3’，反义引物：5’- CTATTGTTGGATCATATTCG-3’，PCR扩增片段为107 bp。RT-PCR扩增条件：50℃ 30 min，94℃ 2 min；变性94℃ 30 s；复性58℃ 30 s及延伸72℃ 1 min，共30个循环。产物进行凝胶电泳。图像分析系统测定灰度比值，目的片段相对表达量=K-ras灰度值/内参β-actin灰度值。

1.5Western印迹检测K-ras蛋白的表达使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺弱胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质、转膜、室温封闭2 h，一抗4℃反应过夜，Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，增强发光底物(ECL)试剂反应发光，X线片显影。图像分析系统测定灰度比值。

1.6四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖情况建立稳定转染细胞系后，以1×104个/ml接种于96孔培养板，100 μl/孔，自转染当天开始，每组每天取3孔细胞，MTT法检测各孔光密度(A)值，以570 nm处吸光度值为纵坐标，绘制出细胞生长曲线。

1.7细胞凋亡检测胰酶消化各组细胞，调整密度为3×105个/ml，冰磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，结合缓冲液重悬细胞，分别加入annexin V-APC 5 μl和PI溶液10 μl，室温避光孵育15 min，流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)检测细胞凋亡情况，使用Cell Quest软件进行分析。

1.8统计学方法应用SPSS13.0软件行单因素方差分析，

2结果

2.1pSilencer3.1真核表达载体的构建及鉴定将重组质粒载体pSilencer3.1-K-ras进行序列分析，测序结果正确，表明重组真核表达载体构建成功。

2.2转染后H441细胞株K-ras mRNA的表达情况pSilencer3.1-K-ras转染组细胞K-ras mRNA表达量(40.8%±4.2%)较对照组(92.3%±3.1%)明显减弱(P<0.05)。空载体组灰度比值为90.6%±1.9%。

2.3转染后H441细胞株细胞K-ras蛋白的表达情况pSilencer3.1-K-ras转染组细胞K-ras蛋白质表达明显抑制。空载体组、阴性对照组、实验组的灰度比值分别为：97.2%±3.1%、96.3%±1.8%、35.1%±2.9%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4siRNA对细胞增殖的影响MMT法所测生长曲线显示实验组细胞增殖速度减慢，细胞生长受到抑制(P<0.05)。

2.5siRNA对细胞凋亡的影响实验组细胞凋亡率明显升高，为26.3%±3.2%，而空载体组、阴性对照组细胞凋亡率分别为6.9%±1.8%、8.6%±3.0%，三组相比差异显著(P<0.05)。

3讨论

EGFR-TKI是近年来肺癌治疗领域的重大突破，研究结果显示，部分NSCLC的EGFR基因存在特定的外显子18-21突变，导致EGFR信号通路持续性激活，造成携带这些突变的肿瘤细胞对EGFR-TKI高度敏感〔1〕。Ras基因定位于染色体11q13，包括H-ras、K-ras和N-ras，其编码的蛋白位于细胞膜上的鸟苷酸结合蛋白，负责将细胞外部信号转导到内部。Ras信号传导通路是EGFR通路的一部分，K-ras基因在多达30%的NSCLC中可出现激活性突变，且以腺癌为主，突变的K-Ras 基因不依赖上游EGFR的活化，不断激活MAPK信号途径的级联反应，导致癌细胞增殖、转移以及抵抗凋亡〔2〕。激活EGFR通路的EGFR突变使得药物更加敏感，而激活EGFR下游ras通路的K-ras突变多引起耐药，甚至同时携带EGFR突变和K-ras突变的肺癌，也可引起原发性耐药〔3〕。对于EGFR下游通路研究显示，突变的K-ras替代EGFR激活下游通路，从而导致EGFR抑制剂耐药的发生。也有研究表明抑制突变K-ras的表达，可有效抑制癌细胞的生长〔2〕。

siRNA是与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默的一种现象。RNA干扰技术的优点是快速、有效且序列特异性强，在某种程度上可替代传统的反义核酸技术及基因敲除技术。研究发现RNAi抑制目的基因的作用强于反义寡核苷酸〔4〕。近年来RNAi技术已逐渐应用于肿瘤的基因治疗研究，并取得一定效果，Brummelkamp等〔5〕应用逆转录病毒将SiRNA导入人胰腺癌、卵巢癌细胞，特异且稳定地抑制癌基因K-ras的表达，使肿瘤生长能力降低，逆转了肿瘤细胞的恶性表型。应用RNA干扰技术特异性阻断突变K-ras基因的表达，可为肺癌的基因治疗提供了新的思路和方法。

本研究结果显示，稳定转染的细胞对吉非替尼的IC50明显下降，提示干扰k-ras能一定程度地恢复H441细胞对吉非替尼的敏感性。细胞的凋亡率和吉非替尼细胞增殖抑制率均明显升高，对吉非替尼的敏感性增强，这表明K-ras-siRNA能够下调H441细胞内K-ras基因的表达，有效抑制ras通路的活化，进而引发一系列的细胞或分子生物学的改变。实验结果提示，通过下调K-ras的表达可以逆转K-ras突变细胞对吉非替尼的耐药，因此，以突变K-ras基因为靶点，利用RNA干扰技术治疗肺癌可望成为有效地基因治疗方法。

4参考文献

1Uramoto H,Mitsudomi T.Which biomarker predicts benefit from EGFR-TKI treatment for patients with lung cancer〔J〕?Br J Cancer,2007;96(6):857-63.

2Forrester K,Almoguera C,Han K.Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis〔J〕.Nature,1987;327(6120):298-303.

3Jackson EL,Willis N,Mercer K,etal.Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras〔J〕.Genes N Dev,2001;15(24):3243-8.

4Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,etal.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals〔J〕.Cell,2000;101(1):25-33.

5Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference〔J〕.Cancer cell,2002；2(3):243-7.

〔2014-11-07修回〕

(编辑袁左鸣)