重庆市肺结核患者异烟肼与丙硫异烟胺耐药状况分析

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结核病仍是当今世界严重危害人类健康的传染性疾病之一，2017年全球估算结核病死亡病例约为157万，全球约有45.9万耐多药结核病患者(MDR-TB)[1]。耐多药结核病的治疗极其困难，这已经成为世界性的难题，因此制定有效的MDR-TB治疗方案对于结核病疫情的有效控制极为重要。异烟肼(Isoniazide, INH)是目前使用的重要的一线抗结核药物，是结核病标准化疗方案的重要组成部分，被称为“全效杀菌药”[2]。目前，INH耐药被认为是耐多药结核病的开始阶段[3]。临床上，结核分枝杆菌对INH耐药后，通常选用丙硫异烟胺(Protionamide, Pto)来代替INH组成治疗方案。Pto和乙硫异烟胺(Ethionamide, Eto)均为异烟酸的衍生物，两者与INH作用相似，均与INH有部分的交叉耐药性，且Pto一旦耐药则不易恢复敏感性[2]。因此，研究重庆市结核分枝杆菌INH与Pto的耐药情况，对INH耐药及耐多药结核病的临床治疗有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 资料

1.1.1菌株来源分析 2015年10月至2017年10月期间重庆市39个区县有传统药敏实验结果并鉴定为结核分枝杆菌复合群的菌株，收集其中INH和Pto任意耐药的菌株288例作为调查对象。所收集的患者菌株中，男性229例，女性59例，年龄15～84岁，平均年龄47岁。根据患者年龄将研究对象分为3组：15～44岁、45～59岁和≥60 岁。

1.1.2相关定义 MDR-TB是指结核病患者感染的MTB经体外药敏试验证实至少同时对INH和利福平耐药；XDR-TB是指在MDR-TB的基础上至少同时对一种氟喹诺酮类和一种二线注射类抗结核药物耐药；Pre-XDR-TB即指对氟喹诺酮类或二线注射药物耐药的患者。

1.2 方法

1.2.1药敏试验及菌种鉴定培养 阳性的菌株采用比例法进行药敏试验[4]。药敏试验包含4种一线抗结核药物：异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(Sm)、乙胺丁醇(EMB)；6种二线抗结核药物：氧氟沙星(Ofx)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、对氨基水杨酸(PAS)和丙硫异烟胺(Pto)。耐药的判断标准：含药培养基生长的菌落数与对照培养基上的菌落数之比≥1%，即为耐药。采用对硝基苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸酰肼(TCH)生长试验对分枝杆菌进行菌种鉴定。

1.2.2质量控制 市级参比室每年接受国家参比室的抗结核药物敏感性熟练度测试，以保证实验室的工作质量。

1.3数据统计分析 收集病例的基本信息及药敏实验结果输入Excel进行管理，采用SPSS21.0软件进行数据分析，结果采用χ2检验进行统计学分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1INH与Pto耐药总体情况 所收集的288例INH和Pto任意耐药的菌株中，INH耐药、Pto敏感菌株为269例，INH敏感、Pto耐药菌株为3例，INH和Pto均耐药菌株为16例。详见表1。

表1 288例菌株INH或Pto耐药状况Tab.1 Drug resistant state of 288 INH or Pto-resistant strains

2.2INH或Pto耐药患者的人群分布 INH和Pto耐药菌株中男性的耐药率均高于女性(79.3%vs20.7%；68.4%vs31.6%)，但在两种耐药菌株中，男性INH和Pto耐药率与女性相比差异无统计学意义(χ2=1.254，P>0.05)。INH耐药菌株中，各年龄段耐药差异不明显；Pto耐药菌株中，年龄15～44岁组耐药率高于45～59岁组(73.7%vs26.3%)，年龄≥60岁组的患者无Pto耐药发生。两种耐药菌株中，年龄15～44岁组Pto的耐药率显著高于INH的耐药率(χ2=9.286，P<0.01)。详见表2。

2.3不同治疗史肺结核患者的耐药情况 两种耐药菌株中，复治患者的耐药率均高于初治患者(INH耐药株：65.6%vs34.4%；Pto耐药株：52.6%vs47.4%)，但初、复治患者INH或Pto的耐药率差异无统计学意义(初治：34.4%vs47.4%；复治：65.6%vs52.6%；χ2=1.316，P>0.05)。详见表2。

2.4不同登记分类 肺结核患者的耐药情况两种耐药菌种中，高危人群的耐药率均高于新患者(INH耐药株：82.8%vs17.2%；Pto耐药株：73.7%vs26.3%)。INH耐药菌株中，登记为复发/返回患者耐药率最高，达45.6%；Pto耐药菌株中，新患者与复发/返回患者的耐药率最高，均为26.3%。各登记分类患者菌株INH或Pto的耐药率差异无统计学意义，详见表3。

2.5INH或Pto耐药菌株中耐多药及广泛耐药情况 INH耐药菌株和Pto耐药菌株中，MDR-TB的发生率均较高(83.5%vs78.9%)，但MDR-TB、XDR-TB发生率在两种耐药菌株中差异无统计学意义(χ2=3.706，P>0.05；χ2=0.218，P>0.05)。Pto耐药组中，Pre-XDR-TB发生率及Ofx耐药发生率要显著高于INH耐药组(36.8%vs11.6%；73.7%vs37.2%)，差异有统计学意义(χ2=9.949，P<0.01；χ2=9.928，P<0.01)。详见表4。

表4 INH耐药株或Pto耐药株耐多药及广泛耐药情况Tab.4 MDR-TB, XDR-TB and Ofx resistance in INH- or Pto-resistant strains

2.6 INH和Pto交叉耐药菌株耐药相关因素分析

2.6.1INH和Pto交叉耐药相关影响因素 在收集的16株INH与Pto交叉耐药菌株中，男性的耐药率高于女性(62.5%vs37.5%)。不同年龄组中，年龄15～44岁组患者的耐药率最高(81.3%)，其次为年龄45～59岁组(18.7%)，年龄≥60岁组患者无交叉耐药发生。不同治疗史患者中，复治患者交叉耐药率高于初治患者( 56.2%vs43.8%)。在交叉耐药的患者中，93.8%为MDR-TB患者，Pre-XDR-TB和XDR-TB的发生率也分别高达37.5%和43.8%。根据地域分布，万州片区交叉耐药菌株比率达56.2%。详见表5。

表5 INH与Pto交叉耐药菌株耐药相关影响因素分析Tab.5 Factors associated with the cross-resistance of INH and Pto

2.6.2INH和Pto交叉耐药菌株耐药谱分析 在16例INH和Pto交叉耐药菌株中，仅1例为多耐药菌株，对6种抗结核药物耐药，其余15例均为耐多药患者，至少对4种抗结核药物耐药，有1例对全部10种抗结核药物耐药，耐药组合类型多达8种。交叉耐药菌株在新患者和高危人群中耐药情况详见表6。

3 讨 论

近年来，INH耐药结核病的发生呈现上升的趋势，且重庆地区MDR-TB患者对二线抗结核药物的耐药情况较为严重，其中，乙硫异烟胺耐药患者在MDR-TB患者中概率高达9.9%[5]。INH与Pto和乙硫异烟胺存在部分交叉耐药性，一旦使用Pto对INH耐药菌株进行治疗，很可能因INH与Pto交叉耐药而导致治疗方案无效。本研究首次对重庆市 INH或Pto任一耐药菌株及其交叉耐药菌株耐药特点进行分析，以期为重庆市INH耐药及耐多药结核病患者的有效治疗提供参考。

表6 INH和Pto交叉耐药菌株耐药谱分析Tab.6 Spectrum of drug resistance in INH and Pto cross-drug resistance strains

本研究收集的INH或Pto任一耐药菌株中，单耐异烟肼菌株高达27株，Pto耐药菌株在MDR-TB中所占比例达6.3%(15/238)，低于李心德等[6]的研究结果(MDR-TB中Pto耐药率为12.9%)。本研究中Pto耐药率比较低，可能是由于表型药敏试验所用的商品化固体培养基的Pto耐药界限值较高，从而导致假敏感[7]；也可能是由于所收集菌株的范围或所采用的药敏方法不同[8]。

研究结果显示，男性耐INH或Pto的比率均高于女性，且年龄15～44岁也是Pto耐药发生的危险因素，这可能与男性和青年人一般是家庭的主要经济支柱，工作压力大，在外工作时间长，流动性大，且治疗依从性较差等因素有关[9-10]。已有相关研究表明，45岁以下是耐多药发生的危险因素[10]。与其他研究结果不尽相同，澳大利亚等国家，女性是耐药发生的危险因素[11]，但也有研究表明，性别与菌株的耐药性无关[12]。这可能是因为耐药与其他各种因素相关，也因各个国家的实际状况不同而有差异。

复治患者耐异烟肼或Pto的概率均高于初治患者，可能与复治患者既往不规律用药、治疗史过多及初治方案选择不当等有关[13]。值得注意的是，即使是初治患者，耐INH或Pto的概率也比较高，尤其是初治患者Pto耐药比率已高达47.4%，这可能与耐药结核病患者就诊不及时、管理不规范，导致耐药菌株的进一步传播有关[14]。有研究表明，传播才是造成耐(多)药结核病流行的主要因素[15]。因此，医生在对初治患者进行治疗时，应根据患者治疗史和耐药结果制定合理的治疗方案，以免因经验性用药造成耐药状况的进一步加剧。另外，相关部门应加强结核病防治知识的宣传，强化患者的健康教育，促进耐药结核病患者的规范管理，减少耐药菌株的传播。重庆市尚未对耐药患者菌株进行基因分型分析，因此重庆市耐药患者的传播情况还有待进一步深入的研究。不同登记分类菌株中，高危人群耐INH或Pto的概率高于新患者，且高危人群中复发/返回及初治2/3月末阳性患者是耐药的主要人群，提示高危人群仍是我们关注的重点对象，应继续做好高危人群的耐药筛查工作。

Pto耐药菌株中，Pre-XDR-TB和Ofx耐药的发生率均高于INH 耐药菌株，提示Pto耐药的MDR-TB患者可能更易发生广泛耐药。有研究报道，Pto耐药与左氧氟沙星耐药相关，左氧氟沙星耐药菌株中更易发生Pto耐药[8]。另有研究显示，MTB对吡嗪酰胺的耐药率随着氟喹诺酮类耐药率的升高而升高[16]。目前对Pto或吡嗪酰胺与氟喹诺酮类耐药相关的确切原因还不太清楚，但氟喹诺酮类耐药与Pto耐药的高相关性可能是由于MTB暴露在氟喹诺酮类药物后产生的氧自由基增加了突变的产生[17]。据报道，一般的细菌感染患者氟喹诺酮类药物的滥用导致了我国氟喹诺酮类药物耐药性的增加[18]。根据本研究，氟喹诺酮类药物的高耐药性很可能导致随后的Pto耐药，从而使包含Pto药物的治疗方案对氟喹诺酮类药物耐药的结核病患者无效。

INH与Pto存在一定的交叉耐药性。本研究中收集了16株INH与Pto交叉耐药菌株，青年人(15～44岁)交叉耐药的发生率仍旧较高，与以前的报道一致[10]。交叉耐药菌株中MDR-TB的发生率高达93.8%，由于Pto耐药与Ofx耐药相关，因此交叉耐药菌株可能更容易发展为XDR。交叉耐药菌株具有一定的区域分布特征，其中，万州片区交叉耐药菌株比率高达56.2%，这可能与该地区医生的用药习惯有关，也可能与该地区耐药患者的管理不规范，造成耐药菌株的传播有关。INH与Pto交叉耐药菌株最少对4种抗结核药物耐药，最多对所检测的10种抗结核药物均产生耐药。但由于本研究目前收集的Pto耐药菌株数量有限，导致本研究可能存在一定的偏差。结核分枝杆菌对INH耐药的主要分子机制与katG、inhA、ahpC和kasA基因突变有关[19]，而Pto耐药与inhA基因突变密切相关[7]。因此，INH和Pto交叉耐药的发生与inhA基因突变的相关性还需要做进一步的分析。

本研究对重庆市近两年INH或Pto耐药及其交叉耐药流行情况进行了分析，表明重庆市结核分枝杆菌Pto耐药与Ofx耐药存在着一定的相关性。因此，应采取相应措施控制氟喹诺酮类药物的使用，以减少广泛耐药的发生。目前，重庆市INH耐药与Pto耐药情况已比较严重，且存在交叉耐药的情况，医生在为INH耐药、Ofx耐药或耐多药结核病患者制定化疗方案时应根据药敏结果，尽量避免经验性用药，以减少更多耐药的发生。

利益冲突：无