动脉粥样硬化斑块钙化与microRNA

孙启玉 贾兴旺 田亚平 (承德医学院附属医院检验科，河北 承德 067000)

目前研究表明急性心血管事件发生的主要原因是冠状动脉粥样硬化(AS)斑块的破裂、出血、血栓形成，而和冠状AS的严重程度不成正比。冠状AS斑块的钙化是其病理发生到一定程度的表现。钙化使斑块变硬、变脆，容易碎裂导致急性心血管事件的发生。

1 AS斑块钙化与心血管事件

病理学上认为AS斑块钙化发生时，在钙化与非钙化交界面由于不同的组织密度使其容易受压破裂。现在越来越多的证据表明钙化可作为AS斑块稳定性的独立预测指标，对冠脉事件的发生有预测价值。Shemesh等〔1〕对稳定型冠心病患者随访观察发现CAC(CAC)积分随时间进展变化。冠状动脉钙化对有症状患者的预测能力得到了广泛研究。Georgiou等〔2〕对192例病人进行随访研究50个月，发现CAC积分和冠脉事件的发生密切相关，高积分病人发生不良事件的风险是低或零积分病人的13.2倍。在一项对458例有急性胸痛且排除急性冠脉综合征(ACS)的病人研究中，有AS斑块钙化的病人比无钙化者更易发生心血管不良事件，其危险比(HR)分别是86.96与58.06〔3〕。对稳定型心绞痛病人，Rijlaarsdam-Hermsen 等〔4〕的研究表明，CAC积分为阴性的病人在随访44个月时无不良事件的发生，其阴性预测价值是100%。CAC对于无症状病人冠脉事件也有很好的预测能力。一项5 000余例患者的前瞻性观察研究发现，与CAC积分＜100的患者相比，＞100的患者4.3年后发生冠脉事件的相对危险度为9.5～10.7〔5〕。Budoff等〔6〕对无症状患者的研究也发现死亡率与CAC积分呈正相关。

鉴于大量有关AS斑块钙化与不良事件发生风险的文献报道。2005美国心脏学会的一份关于临床检测女性冠状动脉疾病的声明写到低CAC和低不良事件发生风险相关，高CAC预示高风险的不良事件。建议对Framingham评分为中度的病人用CAC来评价AS负荷〔7〕。欧洲心血管指南也写到CAC积分是无症状患者未来发生心血管事件风险评价的重要指标，并独立于传统的风险因素〔8〕。

2 AS斑块钙化形成机制及危险因素

以前人们认为血管钙化是磷酸盐矿物质在坏死组织沉积形成的，近年来研究表明AS钙化是一种与新骨形成极为相似的受调控的主动性代谢过程，其钙盐的主要成分是羟磷灰钙，而不是原来认为的磷酸钙。AS钙化出现较早，亚临床的AS早期就出现了骨相关蛋白的表达，当脂质条纹形成时，组织学上就可以检测到钙化的存在〔8〕。

血管平滑肌细胞(VSMC)表型的改变认为是AS钙化的关键步骤。Bobryshev等〔9〕用电镜观察 ApoE基因敲除鼠 AS模型，发现AS脂质斑块周围的平滑肌细胞表现出软骨样细胞特征，在细胞间隙有许多含有羟磷灰石结晶的小囊泡出现，认为平滑肌细胞分化为软骨细胞，导致了斑块钙化的形成。发生表型转换的平滑肌细胞可持续表达和钙化相关的核因子(NF)-κB受体活化因子配体(RANKL)、核结合因子 α1(Cbfα1，Runx2)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素、碱性磷酸酶及骨保护素(OPG)等〔10，11〕。这些蛋白调节骨基质的形成，参与钙化。

炎症和AS斑块钙化的发生有关。脂质过氧化产物的沉积及氧化应激参与粥样斑块的形成。炎症反应导致大量活性氧簇(ROS)产生。体外研究表明H2O2可以通过激活Cbfα1促进VSMC由收缩型向成骨型转化〔12〕。抗氧化作用的高密度脂蛋白及ω-3多不饱和脂肪酸有抑制血管钙化的作用〔13，14〕。氧化低密度脂蛋白能促进β-甘油磷酸盐诱导的VSMC成骨样转化〔15〕。血管钙化，矿物质基质的形成又可作用于单核细胞促进炎症因子的释放〔16〕。

高血糖、血脂是AS发生的危险因素，同时也是硬化斑块钙化的危险因素。糖尿病患者发生CAC比非糖尿病患者显著增加〔17〕。高糖在体外可以通过增加VSMC中Cbfα1转录因子的表达，呈时间依赖性促进VSMC的成骨性转化〔18〕。一项6 093例个体的研究表明高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与CAC有很好的相关性，要高于低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)〔19〕。Orakzai等〔20〕对非高密度脂蛋白(Non-HDL-C)即包含致冠状动脉硬化载脂蛋白B的所有颗粒(极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、乳糜颗粒、脂蛋白a等)和LDL-C、HDL-C、甘油三酯进行比较，认为Non-HDL-C和CAC相关性最强。研究表明血清胆红素水平〔21〕及游离甲状腺素水平〔22〕和CAC呈负相关，其水平降低是AS斑块钙化新的危险因素。

3 AS斑块钙化相关因子

RANKL/OPG参与AS斑块钙化的研究较多。RANKL也称为肿瘤坏死因子超家族成员(TNFSF)11，是前体破骨细胞分化、成熟的启动因子，其主要生理功能之一是促进破骨细胞分化，刺激破骨细胞活化。在不稳定动脉粥样斑块中存在RANKL的表达，来源于转化的VSMC和内皮细胞，这对于斑块中破骨细胞的生成和功能有重要作用〔23〕。RANKL可以和其跨膜受体RANK结合，通过细胞内信号转导激活MAPK，NF-κB，调节多种细胞活性。这些细胞主要是单核细胞来源的破骨细胞前体细胞、T细胞、B细胞和树突细胞〔24〕。RANKL的促破骨细胞作用使其表现为抗钙化因子，能够降低动脉粥样斑块的不稳定性。然而Sandberg等〔25〕的研究表明RANKL可以增加单核细胞趋化因子(MCP)-1及基质金属蛋白酶(MMP)的表达从而诱导斑块的不稳定性。因此RANKL在AS的确切机制有待研究。

OPG是破骨细胞生成抑制因子，在骨代谢调节中起关键性作用，可与RANKL高度亲和而阻碍RANKL同RANK的结合。OPG基因敲除小鼠有严重的骨质疏松，同时2/3的小鼠肾动脉及主动脉中膜发生钙化〔26〕。OPG能抑制维生素D诱导血管钙化小鼠模型的动脉钙化，而血清中钙磷浓度没有发生变化，表明OPG对血管钙化的抑制作用不是通过降低血钙或血磷水平达到的〔27〕。OPG也可抑制载脂蛋白(Apo)E基因缺陷小鼠动脉粥样硬化斑块的钙化〔28〕，表明OPG能够抑制钙化，具有保护作用。Dhore等〔29〕对尸解标本的研究发现，在血管骨样组织钙沉积周围的细胞基质中可以检测到OPG/RANKL，进一步证实OPG/RANKL系统参与 AS和钙化的过程。Jono等〔30〕检测了201例行冠状动脉造影患者的血清OPG水平，研究结果显示冠状动脉狭窄的患者血清OPG水平明显高于无冠状动脉狭窄者，且随着冠脉病变支数及严重程度增加。Mohammadpour等〔31〕的研究表明血清OPG/RANKL比值和CAC显著相关，血清OPG/RANKL有可能成为新的预测心血管事件发生的指标。

OPN、胎球蛋白-A(FA)、人基质γ羧基谷氨酸蛋白(MGP)及瘦素(LP)是除OPG/RANKL系统外和斑块钙化有关且在血中可检测到的蛋白因子。OPN在正常动脉不表达而在钙化的动脉粥样斑块处高表达〔32〕。OPN抑制羟磷灰石的生长，增加其在酸性环境的分解〔33〕。体外实验证明OPN敲除小鼠VSMC更易产生钙化，表明OPN有抑制钙化的血管保护作用〔34〕。Uz等〔35〕认为血清OPN水平可以评价可疑冠心病人冠状动脉钙化程度。Minoretti等〔36〕的研究表明血清OPN水平可以预测稳定心绞痛患者不良心血管事件的发生，具有危险分层的价值。Georgiadou等〔37〕进一步证明血清OPN水平在缺血性心脏疾病有很好预测价值。

FA在肝脏表达后进入血液循环，主要聚集在骨骼。FA的N端富含酸性氨基酸残基，与碱性磷酸钙结合形成可溶性无定形胶体微球，从而增加其溶解度，抑制血清过饱和的钙磷盐沉积。研究表明VSMC摄取FA后其钙化能力降低〔38〕。在血液透析患者，低血清FA水平和CAC相关〔39〕。但另一项研究认为血清FA水平和CAC无关〔35〕。

MGP能够直接抑制血管壁矿物质的沉积，也可通过抑制骨形态发生蛋白(BMP)-2和BMP-4的活性抑制VSMC的成骨性转化〔40，41〕。MGP抑制血管钙化的活性依赖于其谷氨酸残基的羧基化，而维生素 K是催化这一反应的必需辅助因子〔42〕。MGP敲除小鼠动脉自发发生钙化，其平滑肌细胞失去一些收缩型标志物，而Cbfa1、OPN及骨钙素和这些成骨相关的蛋白表达增加〔43〕。一项临床实验表明对于可疑冠心病患者，血清MGP水平和CAC呈负相关〔44〕。但另一项研究却表明血清MGP水平和AS的危险因素相关，而和动脉钙化无关〔45〕。

LP是一种脂肪组织分泌的肽类激素，进入血液循环后作用于LP受体，参与糖、脂肪及能量代谢的调节。LP有增加血管内皮细胞氧自由基生成，促进泡沫细胞形成，诱导内皮细胞增生，MMP表达等多种生物学效应。促进AS发生发展〔46，47〕。体外研究表明LP可通过抑制糖原合成酶(GSK)-3β的活性，呈剂量依赖增加VSMC的成骨性转化〔48〕。在ApoE敲除小鼠动物模型，给予腹腔注射LP能够促进AS斑块钙化的发生〔49〕。对无临床症状患者及2型糖尿病患者的研究表明血清LP水平独立于传统风险因素和 CAC 相关〔50，51〕。Iribarren 等〔52〕的研究表明血清LP水平和年老女性患者的CAC相关，但该作用不是独立的，和血脂、血压、胰岛素抵抗等其他因素相关。

关于血清炎症相关因子作为斑块钙化的指标有争议。Hamirani等〔53〕总结了12篇有关血清炎症因子和CAC的文章，测定的炎症因子包括C反应蛋白(CRP)、MMP-9、纤维蛋白原、MCP-1、人抵抗素、脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α及成纤维细胞生长因子(bFGF)，发现炎症因子与斑块钙化的关系是微弱的，建议有计划的大规模研究。Jenny等〔54〕对6 783例不同种族亚临床症状患者的血IL-6，CRP，纤维蛋白原进行研究，发现三者和CAC都有一定相关性，但在排除冠心病风险因素后，只有IL-6和CAC相关。最近，一项对455例个体20种炎性因子的研究表明，IL-6、IL-8和 IL-13与 CAC明显相关，而 CRP缺少联系〔55〕。Li等〔56〕认为CAC和炎症因子CRP的升高可能有着不同的病理生理机制，是两者缺少相关性的原因。血清炎症因子的改变和AS斑块钙化均与心血管事件的发生密切相关。

4 microRNA参与VSMC成骨性转化

microRNAs(miRNAs)是一种小的内源性非编码RNA分子，大约由21～25个核苷酸组成。这些小的miRNA通常靶向一个或者多个mRNA，在翻译水平抑制或断裂靶mRNAs调节基因的表达，参与细胞增殖、分化、迁移和调亡。已发现microRNAs和多种疾病相关。AS斑块钙化由多种蛋白因子参与调节，和蛋白表达密切相关的microRNAs必然发挥重要作用。已发现microRNAs参与VSMC的表型转化。

miR-204在心肌及 VSMC中表达。Cui等〔57〕培养小鼠VSMC细胞发现miR-204在β-甘油磷酸盐诱导的VSMC钙化过程中显著下降，认为miR-204与钙化发生相关。碱性磷酸酶(ALP)是破骨细胞分化前期的标志，骨钙素是成骨细胞分化中期既骨基质形成阶段的标志。抑制miR-204能够增加VSMC的ALP、骨钙素及Runx2的表达。相反，过表达miR-204能抑制VSMC的钙化。Runx2是成骨细胞分化重要转录因子。进一步研究证明miR-204是通过下调Runx2抑制VSMC钙化。miR-125b是除miR-145、miR-23、miR-143外在动脉表达丰富的microRNA之一。培养人冠状动脉VSMC在成骨性转化过程中miR-125b的表达明显下降，抑制内源性miR-125b可以增加VSMC ALP的表达及基质的矿物质化。在体内，ApoE敲除诱导的小鼠动脉钙化模型中，miR-125b含量显著下降。miR-125b参与了VSMC的成骨性转化，该作用可能是通过SP7转录因子实现的〔58〕。最近 Gui等〔59〕应用血管钙化动物模型筛选出miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712为差异表达 microRNAs，并在体外培养VSMC中进行证实。这些microRNA的作用靶点为NCX1、PMCA1和 NCKX4，它们均为和Ca离子通道相关蛋白。miR-135a、miR-762、miR-714和 miR-712与 Ca及 Pi诱导的VSMC成骨性转变相关。

AS斑块钙化的发生是多种蛋白因子及microRNAs相互作用的结果，对其发病机制的了解，有利于寻找血清标志物帮助临床诊断及危险分层，并为靶向药物治疗提供线索，对于降低急性心血管事件的发生非常重要。

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