荧光原位杂交技术在上尿路上皮细胞癌诊断中的应用

易文发 曹会彦 刘智明 乜国雁 章晓东 王国录 于 湧

(青海省人民医院泌尿外科，青海 西宁 810007)

上尿路上皮细胞癌(肾盂、输尿管癌)是一种较为罕见的肿瘤，年发病率(0.7～1.1)/10万，在过去的30年略有增加。2009年我们应用荧光原位杂交技术(FISH)初步探讨了其在中国人群中诊断膀胱癌的作用〔1〕。分子遗传学研究表明，上尿路尿路上皮和膀胱上皮组织来源、遗传学改变相同，应用FISH检测上尿路尿路上皮细胞癌在理论上是可行的〔2〕。本文探讨FISH在早期诊断上尿路尿路上皮细胞癌中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 50例无肉眼血尿及其他泌尿系统疾病的正常对照组，年龄46～82(平均62.6)岁。56例疑似尿路移行上皮肿瘤的肉眼血尿患者组，男44例，年龄47～83(平均60.4)岁，女12例，年龄50～84(平均64.2)岁。所有入选病例均签署知情同意书。

1.2 尿液留取及检测 106例入选病例连续3 d留取晨尿200 ml，1 h内送检，一部分进行FISH检测，另一部分经离心后制备脱落细胞玻片，由指定的经验丰富的病理科医师进行细胞形态学检查。

1.3 FISH检测方法 采用金菩嘉医疗科技有限公司提供的DNA探针。其中包括CSP3/CSP7和GLP P16/GLP P17探针，采用荧光显微镜检查，均可见红色与绿色两种信号。GLP P16/GLP P17DNA探针常见异常类型主要为P16缺失;17号染色体呈非整倍性，正常细胞检测结果应为2红2绿，异常信号主要包括:0红 2绿、1红 2绿、1红 3绿及 2红 3绿。CSP3/CSP7DNA探针常见异常表现为3号及7号染色体呈非整倍性，正常细胞检测结果应为2红2绿，异常信号主要包括:2红3绿、3红2绿及3红3绿等。

1.3.1 准备探针混合物和变性 室温下将7 μl杂交缓冲液、1 μl去离子水和2 μl DNA探针加入微量离心管中，将其离心1～3 s。将装有10 μl以上DNA探针混合物的试管置于(73±1)℃水浴箱变性5 min，之后，将该试管放置于45℃ ～50℃水浴箱中，在杂交前将混合物试管取出。在探针准备好的同时应将载玻片置于45℃ ～50℃烤片机上预热。

1.3.2 探针与样本杂交 将10 μl变性后的探针混合物滴于载玻片杂交区域后立即加盖盖玻片，用橡皮胶将边缘密封，随后，将载玻片放置于提前预热的湿盒中，在42℃保温箱中进行过夜杂交。

1.3.3 玻片洗涤 在室温下将配置好的50%甲酰胺/2×(SSC)溶液(A 液)倒入三个分别标记为“a”、“b”、“c”的考普林瓶中。注意在使用前应将盛有溶液的考普林瓶放置于(46±1)℃水浴箱中预热至少30 min，以使溶液达到实验所需要的温度。然后，分别将50 ml 2×SSC溶液(B液)和2×SSC/0.1%NP洗液(C液)倒入考普林瓶中，同上，在使用前应将盛有溶液的考普林瓶预热至少30 min，使溶液达到所需温度。下一步，移去盖玻片，立即将载玻片置于“a”中，晃动玻片1～3 s。按此步骤重复另外几张载玻片，5～10 min后取出。然后，将载玻片置于“b”中，晃动1～3 s，5～10 min后取出。同样，将载玻片置于“c”中，晃动玻片1～3 s，5～10 min后取出玻片。后将载玻片置于盛有B液中，晃动玻片1～3 s，10 min后取出玻片。重复上述步骤，将载玻片置于盛有C液中，晃动1～3 s，5 min后取出，最后，室温浸泡在70%乙醇中，3 min后取出。

1.3.4 观察方法 暗室内使载玻片自然干燥，然后将5 μl DAPI复染剂滴加在杂交区域，立即盖上盖玻片。在暗处放置10～20 min后，荧光显微镜下选用合适的滤波片组进行观察。

1.4 FISH检测结果判定 荧光显微镜下观察不典型细胞以便对玻片进行评估，同时对上述细胞中信号的数目计数。对每个样本每种探针各分析100个细胞，如果检测值大于阈值，则判定为阳性结果;如果检测值小于阈值，则判定为阴性结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件行χ2检验。

2 结果

2.1 诊断阈值 50例正常人尿液阈值分析为:CSP3、CSP7、GLP、P16、GLP P17有1个信号点的细胞比例分别为:9.22%、6.76%、5.95%及6.78%;有3个及以上信号点的细胞比例分别为11.92%、12.64%、5.18%及7.66%。

2.2 FISH检测的结果 以输尿管镜检查和术后病理检查为诊断标准，56例行FISH检测的患者，通过输尿管镜活检或手术后病理检查明确诊断为上尿路上皮细胞癌患者51例，泌尿系良性病变为5例，包括输尿管炎性病变、输尿管结核等。

2.3 FISH在上尿路上皮细胞癌诊断中的敏感性和特异性对106例行FISH检测的病例对于肿瘤的敏感性为91.1%，特异性为92.0%。尿脱落细胞学的敏感性为33.9%，特异性为94.0%。FISH与尿脱落细胞学在诊断上尿路上皮细胞癌中敏感性有统计学意义(P＜0.01)，特异性无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

上尿路上皮细胞癌较罕见，其占尿路上皮细胞癌的5%〔3〕，目前，上尿路上皮细胞癌的早期诊断相对比较困难，其诊断方法主要依靠尿脱落细胞学、输尿管镜及影像学检查。尿脱落细胞学检查虽然特异性较高，但由于灵敏度低，仅为21% ～60%〔4〕，在上尿路尿路上皮细胞癌的早期诊断中的作用极为有限，此点在本次研究中亦有所体现，另外，尿脱落细胞学阳性判断与检验者的经验、水平有很大的关系〔5〕，不能提供一个较为客观的结果。输尿管镜为我们提供了一种灵敏度较高的方法，但缺点在于其为有创检查，患者痛苦，难以接受，且有可能发生输尿管穿孔等严重并发症，限制了它的广泛应用，另外，输尿管镜检查对原位癌的检查阳性率极低，很难明确诊断〔6〕。影像学检查包括泌尿系超声、CT、MRI等检查，虽说有一定的诊断价值，但对早期的上尿路尿路上皮细胞癌的诊断较为困难〔7〕，往往有特征性表现时已经发展为中晚期，预后不佳。

FISH是比较新兴的分子遗传学技术，目前它已广泛应用于动植物基因结构、人类产前诊断、肿瘤遗传学病毒感染分析、染色体精细结构变异分析以及基因进化研究等各领域。FISH检测的主要方法是采用荧光标记的DNA探针，依据DNA探针与被检测样本中DNA序列的互补性，将两者杂交后在荧光显微镜下检测DNA序列进行定位、定性以及相对定量分析。此项技术本身操作相对简单，重复性好、稳定，并具有极高的敏感性和特异性。正由于FISH有上述技术特点及优越性，作为一门新技术其被越来越多地应用于临床医学检测。

本研究结果说明应用FISH技术进行遗传学改变的检测对上尿路上皮癌的早期诊断具有良好效果，表明其灵敏度明显高于细胞形态学检测，而特异性则与细胞形态学相当。FISH相比输尿管镜及尿脱落细胞学检查具有无创、敏感性及特异性高等优点，对经过输尿管镜和尿脱落细胞学检查结果阴性而又高度怀疑上尿路上皮癌的患者来说又多了一种无创、简便、高效的检测方法。

本研究中，FISH组出现5例假阴性，可能与肿瘤小、级别低、仅限于黏膜层致尿脱落细胞少或细胞尚未发生遗传学改变有关〔8〕。出现4例假阳性，也许并不能完全排除尿路上皮癌的可能，有报道指出在11例检查阴性而FISH检测阳性的患者在3～12个月的随访中发现7例罹患尿路上皮癌〔9〕。说明虽然经输尿管镜等检查结果阴性而FISH阳性的患者，日后其患尿路上皮癌的风险仍很高，需密切随诊。本研究将对4例假阳性病例长期随访，进一步证实其是否为尿路上皮癌高风险病例。

综上，FISH作为一种新兴技术在上尿路上皮细胞癌的早期诊断和预后评估中相比尿脱落细胞学显示出其高敏感性、高特异性及无创性的优点。但因其探针相对价格较高，目前广泛应用于临床尚有一定的难度。随着此项技术的成熟及试剂成本的降低，相信FISH技术在上尿路尿路上皮细胞癌的早期诊断中将有着广泛的临床应用前景。

1 曹会彦，刘智明，乜国雁，等.荧光原位杂交技术在膀胱癌诊断中的临床应用〔J〕.中国老年学杂志，2011;31(15):2809-11.

2 Fadl-Elmula I，Gorunova L，Mandahl N，et al.Cytogenetic analysis of upper urinary tract transitional cell carcinomas〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，1999;115:123-7.

3 Oosterlinck W，Solsona E，Van der Meijden AP，et al.EAU guidelines on diagnosis and treatment of upper urinary tract transitional cell carcinoma〔J〕.Eur Urol，2004;46:147-54.

4 Mian C，Mazzoleni G，Vikoler S，et al.Fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of upper urinary tract tumours〔J〕.Eur Urol，2010;58:288-92.

5 Lotan Y，Roehrborn CG.Sensitivity and specificity of commonly available bladder tumor markers vs cytology:results of a comprehensive literature review and meta-analyses〔J〕.Urology，2003;61:109-18.

6 Siemens DR，Morales A，Johnston B，et al.A comparative analysis of rapid urine tests for the diagnosis of upper urinary tract malignancy〔J〕.Can J Urol，2003;10:1754-8.

7 Mills IW，Laniado ME，Patel A.The role of endoscopy in the management of patients with upper urinary tract transitional cell carcinoma〔J〕.BJU Int，2001;87:150-62.

8 Jose P，Blanca E，Marta S，et al.Clinical utility of a multiprobe FISH assay in voided urine specimens for the detection of bladder cancer and its recurrences，compared with urinary cytology〔J〕.Eur Urol，2002;42:547-52.

9 Halling KC，King W，Sokolova IA，et al.A comparison of cytology and fluorescence in situ hybridization for the detection of urothelial carcinoma〔J〕.J Urol，2000;164(5):1768-75.