人中性粒细胞对结核分枝杆菌杀伤活性的检测方法

贺文欣　姜丽娜蔡　辉李柏青(蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室，安徽　蚌埠　233030)



人中性粒细胞对结核分枝杆菌杀伤活性的检测方法

贺文欣姜丽娜1蔡辉1李柏青1(蚌埠医学院组织学与胚胎学教研室，安徽蚌埠233030)

〔摘要〕目的探讨用FDA标记Mtb的最佳浓度，观察不同化学试剂和温度对FDA标记率的影响及PMNs杀伤Mtb的活性。方法用不同浓度荧光素二醋酸酯(FDA)标记Mtb，选取最佳标记浓度，在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中孵育30 min，或与不同百分比的乙醇、甲醛和多聚甲醛(PFA)试剂在室温下孵育30 min后洗涤，用流式细胞术检测标记率和荧光强度(MFI); Percoll分离获得PMNs与FDA标记的Mtb于37℃孵育7 min，洗涤，加入自体血清，置37℃孵育0～60 min，计算PMNs对Mtb的杀伤率。结果Mtb用不同浓度FDA在PBS中标记的标记率分别从由85%增加到99%，MFI分别从45增加到1 506;在0℃冰浴，37℃、65℃、95℃水浴作用30 min后，FDA-Mtb的标记率从0℃的99%下降至95℃的0. 21%，MFI从0℃的2 015下降至95℃时的87; FDA标记的Mtb与不同比例的常规化学试剂乙醇、甲醛、多聚甲醛分别作用30 min后，FDA-Mtb的MFI在各组均显著降低(P＜0. 01); FDA标记的Mtb与分离PMNs在37℃作用0 min、10 min、30 min和60 min，PMNs杀伤Mtb的百分率分别是11. 37%、12. 02%、27. 20%、58. 44%。结论流式细胞术能快速准确地检测PMN对FDA标记Mtb的杀伤活性，且杀伤活性随时间延长而增强。

〔关键词〕中性粒细胞;结核分枝杆菌

1蚌埠医学院感染与免疫安徽省重点实验室

第一作者:贺文欣(1980-)，男，硕士，讲师，主要从事细胞免疫、神经生物学研究。

中性粒细胞即多形核细胞(PMNs)，是机体最重要的炎性细胞，当外来病原体进入机体时，PMNs就会向病原体处集结，进行吞噬活动，继而消化和降解病原体，发挥天然免疫清除病原体的效应〔1～3〕。以往的研究表明，机体感染结核分枝杆菌(Mtb)后，发挥抗结核免疫主要是细胞免疫，且在急性结核病发病早期，PMNs首先吞噬Mtb，并且PMNs是活动性肺结核病人感染过程中占最主导地位的吞噬细胞〔4～6〕，但其发挥的生物学效应却绝不仅仅是简单的吞噬作用。以往用于评价Mtb杀伤活性的方法由于受到Mtb生长缓慢的限制，实验周期较长，而且操作繁琐，影响因素较多，因此并不理想。据此，寻找新的检测Mtb杀伤活性的方法尤为重要。本文希望为检测Mtb杀伤活性寻找一种快速简便的方法。

1　材料与方法

1. 1 Mtb的培养和悬液的制备Mtb H37Ra(批号: 9302025)，购于中国药品生物制品检定所北京菌种保藏中心。将Mtb H37Ra培养于含有10%小牛血清的改良苏通氏液体培养基中，并置于37℃恒温培养箱内，当达到对数生长期时(约1个月)，用无菌接种环取出部分菌接种到罗琴氏固体培养基上培养。当固体培养基上长出新鲜成蔟的Mtb时，用无菌接种环取少许Mtb置于EP管中，用研磨棒进行反复研磨，加入生理盐水洗涤2次，离心10 000 r/min，2 min，再用1 ml注射器加入少许0. 9% NaCl对细菌悬液反复吹打，使其分散为单个菌悬液。分光光度计600 nm处检测菌液浓度，用0. 9% NaCl调细菌浓度为5× 108/ml，分装EP管中，置于4℃冰箱待用。

1. 2荧光素标记Mtb的制备取Mtb悬液，离心13 000 r/min，2 min，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7. 2)配成浓度为5×108/ml的悬液，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μmol/L)，FDA终浓度为0. 025～2. 0 μmol/L，然后置37℃25 min后，离心13 000 r/min，2 min，弃上清，PBS洗涤2次;配成浓度为5× 108/ml细菌悬液，避光保存于4℃备用。流式细胞术检测Mtb标记率及FDA标记的Mtb存活率，取5×108/ml未标记Mtb菌液100 μl，加入DMSO配制的FDA溶液(100 μM)1 μl，然后置37℃25 min后，离心13 000 r/min，2 min，弃上清，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测Mtb的FDA标记率。

1. 3流式细胞术检测温度对FDA标记的Mtb存活率的影响将存活率＞95%的FDA标记的Mtb 100 μl分别放置在0℃冰浴，37℃、65℃和95℃水浴中，30 min后取出，PBS洗涤2次，每次离心13 000 r/min，2 min，弃上清，重悬，再用流式细胞仪检测。每个样品收集1×104个细胞，检测Mtb的FDA阳性率和阴性率。

1. 4流式细胞术检测不同常规化学试剂对FDA标记的Mtb存活率的影响将存活率＞95%的FDA标记的Mtb 100 μl加入1. 5 ml EP管中，每管各加入终比例为55%、65%、75%乙醇、50%、75%、95%甲醛和0. 5%、1%、2%的多聚甲醛试剂，室温下放置30 min，PBS洗涤2次，每次离心13 000 r/min，2 min，弃上清，重悬，再用流式细胞仪检测。

1. 5 PMN的分离采集健康自愿者(均来自本院健康教职工和学生)外周静脉血5 ml，经1 500 r/min水平离心5 min后，取红细胞上的“白膜”层，用1 ml 1640稀释，继续在玻璃离心试管中依次加入75%与60% Percoll液和1640稀释的“白膜”层，三者体积比为2∶2∶1，2 000 r/min水平离心20 min，吸取60%与75% Percoll液的界面层中PMN，用完全1640充分洗脱Percoll胶粒后，加入灭菌纯净水2 ml振摇20～30 s，迅速加入2 ml 1. 8%NaCl溶液混匀，1 500 r/min水平离心5 min后，用完全1640制成浓度为1×106/ml的细胞悬液。

1. 6流式细胞术检测人外周血分离的PMN对FDA标记Mtb的杀伤率取流式管，每管加入已分离的1×106/ml的PMN细胞悬液25 μl，再加入5×108/ml FDA标记的Mtb菌液20 μl，混匀后置37℃水浴，7 min后迅速取出，加冰冷的PBS洗涤1次后再用冰冷的RPMI1640洗涤一次，后加入自体血清20 μl/管，然后分成两组置0℃冰浴和37℃水浴，每管分别在0、10、30和60 min时间段，立即加入100 μl 1%的脱氧胆酸钠(DOC)并在原温度下保持5 min，再加入无菌三蒸水，250 μl/管，2 min，用流式细胞仪检测。同时设定全血加入未标记细菌组(空白对照)。

1. 7统计学处理采用SPSS16. 0软件行单因素方差分析(one-way ANOVA)及q检验。

2　结果

2. 1不同浓度荧光素FDA对Mtb标记率和平均荧光强度(MFI)的影响不同浓度FDA标记Mtb标记率0. 1、0. 5、1. 0 μmol/L FDA的标记率分别为83. 33%、99. 56%、99. 67%。有显著性差异(P＜0. 01)，随着FDA浓度增加标记率逐渐增高。不同浓度FDA标记的Mtb-MFI有显著性差异(P＜0. 01)，FDA浓度为0. 01、0. 5、1. 0 μmol/L时MFI分别为49. 73±8. 53、208. 64±2. 93、784. 75±15. 94、1 463. 82±33. 49。

2. 2温度对FDA标记的Mtb存活率的影响存活率＞95%的FDA标记的Mtb 100 μl在不同温度下作用30 min后，随着温度的升高，不同温度对FDA-Mtb的标记率即存活率有显著影响(P＜0. 01)，标记率随温度增加而降低;而且，用不同温度作用FDA-Mtb时，温度对MFI也有不同影响。不同温度对FDA标记的Mtb-MFI有显著性差异(P＜0. 01)，0℃、37℃、65℃、95℃时mFI分别为200 1. 64±594. 83，1 038. 94±89. 47，64. 85±11. 72，48. 42±19. 03。

2. 3不同常规化学试剂对FDA标记的Mtb存活率的影响存活率＞95%的FDA标记的Mtb 100 μl在不同化学试剂作用30 min后，发现随着加入试剂百分率的增加，同一化学试剂对FDA-Mtb的MFI有显著影响(P＜0. 01)，在乙醇组，MFI从对照组的1 597下降至325;甲醛组下降至118，多聚甲醛组下降至185，MFI均随着加入试剂百分率的增加而下降。

2. 4分离PMN对FDA标记的Mtb的杀伤的时间动力学Mtb与分离PMN在37℃作用0、10、30和60 min，PMN杀伤Mtb的百分率分别是11. 37、12. 02、27. 20、58. 44。两者在37℃作用0～60 min PMN杀伤Mtb的百分率呈递增趋势(P＜0. 01)。

3　讨论

PMN作为职业吞噬细胞，在机体的抗感染免疫中扮演着重要的角色，是机体最重要的炎性细胞，在急性感染早期发挥重要的作用。在炎症反应中，PMN到达炎症发生的部位，其表面有可识别细菌的受体，吞噬病原体的过程包括趋化、识别结合、内吞、氧依赖性杀伤和氧非依赖性杀伤等。以往的研究表明，在急性结核病发病早期，PMNs首先吞噬Mtb〔7～9〕，并且PMNs是活动性肺结核病人感染过程中占最主导地位的吞噬细胞，而其发挥的生物学效应却绝不仅仅是简单的吞噬作用，要比以往研究的其所发挥的作用复杂得多。Scott等〔10〕曾经建立了较为新型的检测Mtb药敏实验的方法，即通过荧光素二醋酸乙酯(FDA)标记Mtb，用流式细胞仪检测抗Mtb药物活性，操作简单，重复性好，结果准确。特别是其操作时间短暂，24 h内就可以获得结果。FDA可作为活细胞染料，能够轻易地通过细胞膜进入细胞内，被细胞内存在的酯酶水解，保留在细胞内呈较强的绿色荧光，而坏死和凋亡的细胞，则不发荧光。

通过本文实验，我们明确了用FDA来标记Mtb，都可以用流式细胞仪快速准确地检测其标记率和MFI，并且标记率和MFI反映的就是Mtb的存活率。PMN杀伤Mtb的量随时间呈增加趋势，且在30 min左右杀伤值增加较为明显。实验中体会到，PMN吞噬和杀伤Mtb是连续的过程，并且受温度影响较大，因此控制整个实验温度对实验结果甚为重要。洗涤的过程全部用4℃的冰冷的PBS进行，在全血组用氯化铵溶解红细胞时，将操作放置在15℃～18℃的水浴中进行，这样也能避免复杂操作引起的细胞活化而导致检测结果的改变。用1%的脱氧胆酸钠(DOC)和冰冷三蒸水来使残留的荧光素与PMN分离，并且破裂细胞使其漏出，以保证实验结果的准确性。用流式细胞仪检测PMN对Mtb杀伤活性的影响，所需标本量少，检测快速、简单，准确。总之，本实验通过用荧光染料和流式细胞术，检测了FDA对Mtb的标记率，以及体外因素对标记率的影响，并且用流式细胞术检测了分离PMN对不荧光素标记的Mtb杀伤的时间动力学，为今后本实验的流式细胞术研究和临床抗结核的辅助治疗提供了依据。

4参考文献

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〔2014-12-25修回〕

(编辑徐杰)

基金项目:感染与免疫安徽省重点实验室(蚌埠医学院)开放课题(BYKL1302)

〔文章编号〕1005-9202(2015)20-5689-03;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 005

〔文献标识码〕A

〔中图分类号〕R378