前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因与脂质代谢

吴柳松 钱民章 (贵州省遵义医学院生物化学教研室，贵州 遵义 563004)

1 前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)简介

Seidah等〔1〕在研究神经元发育分化时发现一个新基因，称为PCSK9，该基因编码是一种前蛋白转化酶，名为神经细胞凋亡调节转化酶1(NARC)-1，该酶参与肝细胞发育再生和神经细胞分化〔1〕。后续研究发现，PCSK9蛋白能靶向降解低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)，与脂质代谢、异常胆固醇血症及动脉粥样硬化等有密切关系。

人PCSK9基因位于染色体1p32.3，全长29 kb，含12个外显子，编码区约为2 kb，cDNA序列具有3 617 bp，编码的NARC-1为692个氨基酸残基的前体蛋白，是一种新的分泌型丝氨酸蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族(PC)。其氨基酸全序列可分为信号肽(SP 1～30)、前结构域(prodomain，31～152)、催化结构域(Catalytic domain，153～452)、羧基末端结构域(C-terminal，526 ～ 692)〔1〕。PCSK9 基因启动子区域含有保守的Sp1和体内固醇调节元件(SRE)位点。PCSK9蛋白合成分泌时，首先在内质网中合成一个 PCSK9酶原(apo-PCSK9，74 kD)，可溶性酶原在151～152残基处发生自动催化分裂，释放N末端前导区域，并结合至催化区域，前片段分裂之后，成熟的 PCSK9(60 kD)存在于内质网并被分泌进入血液〔2，3〕。

PCSK9主要在肝脏和肠道表达，在肾脏、皮肤、脾脏、脑、神经系统及血管平滑肌等组织中也有少量表达，在神经上皮瘤SK-N-MCIXC，结肠癌 LoVo-C5，人肝癌 HepG2，肝 BRL-3A，胰岛TC3，淋巴白血病Rin-m5F和Schwann细胞系中均有高表达。目前已证实，体内SRE结合蛋白(SREBP)-1a、-1c和-2均可上调PCSK9的表达〔4，5〕。肝X受体(LXR)激动剂和胰岛素也可上调PCSK9的表达，且胰岛素和LXR的激动剂上调PCSK9表达均是通过SREBP-1c介导的〔4〕。研究还发现，他汀类降脂药也可上调PCSK9的表达〔6〕，PCSK9的表达还与年龄、性别以及其他多种机制代谢程度密切相关〔7〕。

2 PCSK9与LDLR

大量研究表明，PCSK9可通过靶向降解细胞表面的LDLR来减少肝摄取LDL，使血浆LDL清除减少和LDL胆固醇(LDLC)升高，从而影响体内脂类代谢调节。

研究发现，用腺病毒介导PCSK9在野生型鼠中过表达，鼠肝中LDLR显著减少，血浆LDL水平升高;在PCSK9的一些突变体内也可观察到同样结果〔8〕。另外，在培养的肝细胞中过表达PCSK9，细胞表面LDLR水平和活性明显降低。然而，在PCSK9敲除的肝癌细胞中，LDLR水平和活性升高〔9〕。在PCSK9缺陷的鼠肝中，同样检测到LDLR水平和活性明显升高。另有研究进一步证实，在C57BL/6鼠内，PCSK9可明显抑制肝脏LDLR的表达，减少LDL肝摄取，从而使血浆LDL水平显著升高〔10〕。

PCSK9是通过阻断LDLR从内涵体到细胞表面再循环从而介导其降解。首先，PCSK9与细胞表面LDLR结合形成复合物，结合时，二者构象发生特殊改变，以促进复合物转载LDLR和PCSK9循环再利用。随后，复合物进入内涵体，内涵体酸性环境使PCSK9与LDLR亲和力增加150倍，二者结合更为紧密。最后，复合物将LDLR送入溶酶体降解，PCSK9从复合物中分离并重新利用。研究表明，PCSK9介导LDLR降解可能同时受到血浆LDL、极低密度脂蛋白(VLDL)及某些特殊组织因子调节〔11〕，且PCSK9介导的LDLR降解并不受蛋白酶抑制剂、门冬氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂及基质金属蛋白酶抑制剂的影响〔12〕。PCSK9对LDLR的降解仅仅发生在蛋白水平，在PCSK9基因敲除后的小鼠，其血浆胆固醇水平比野生型小鼠显著下降，而其肝脏 LDLR蛋白表达明显增加，但相应的mRNA表达却没有变化〔13〕。

他汀类降脂药可上调PCSK9基因表达，影响其降脂效果。在PCSK9基因敲除鼠中，使用他汀类药时，其LDLR的量明显高于野生型鼠，血脂对降脂药的敏感性增高〔14〕。

Chan等〔15〕研究发现，PCSK9的抗体 mAbl与 PCSK9结合后抑制PCSK9与LDLR的结合，减少其对LDLR的降解，可降低LDL-C水平。在野生型小鼠中，mAbl可以升高LDLR水平2倍，同时可以降低血清总胆固醇36%，而在LDLR-/-小鼠中却没有观察到这些效应。当mAbl与他汀类药物联用时，可提高他汀类药物的降脂效果。因此，PCSK9拮抗剂为降低LDL-C提供了新的策略〔16〕。目前，一些新的 PCSK9单克隆抗体如AMG145、RN316等正在被试验于临床实验。虽然这些抗体目前仍处于临床研发初期，但结果已经开始让人兴奋，因为这些抗体降低LDL效果显著，似乎可以成为他汀类药物的添加剂，希望其可以使绝大多数患者达到LDL的控制目标。

这些研究表明，PCSK9能够调节肝脏LDLR蛋白的数量，影响LDLR介导的LDL的摄取，从而影响胆固醇的水平，并提示PCSK9抑制物与他汀类药在提高LDLR和减少血浆胆固醇方面具有协同作用。这将为靶向PCSK9的新药研发提供新的思路。

3 PCSK9突变与血清胆固醇水平

PCSK9有多种序列变异，涉及许多生理及病理过程。PCSK9不同的突变类型，对血浆胆固醇水平有不同的调节作用。PCSK9突变形式按PCSK9调节LDLC水平，可分为功能获得型突变和功能缺失型突变两类。

3.1 PCSK9功能缺失型突变与低胆固醇血症 PCSK9功能缺失型突变可削弱或灭活PCSK9降解LDLR的能力，导致肝细胞LDLR的增多，血液中LDL被摄取降解增加，进而引起低胆固醇血症。主要缺失型突变形式有G106R、A443T、R46L、Y142X、SR97、L253F、C679X 和 Q554E 等〔17〕。非洲人群中低胆固醇血症均源于PCSK9突变，其突变率高于其他任何种族。

在对1 769例美籍非洲人构成的低胆固醇血症人群调查发现，有33例与PCSK9的2个功能缺失型突变Y142X和C679X有关。这些突变个体胆固醇内源性生物合成和肠吸收没有变化，说明PCSK9功能丧失使LDLR表达和活性增加〔14〕。另外，PCSK9其他功能缺失型突变(如R46L)也可引起低胆固醇血症，降低冠心病发病率。有调查显示，与正常基因型人群比较，PCSK9功能缺失型突变可使心血管类疾病发病率降低88%，而药物治疗仅能使其降低23%。他汀类药的降脂效果在这类基因突变的个体上非常明显，PCSK9基因的 R46L、G106R、N157K和R237W等突变型对他汀类药治疗的敏感性增加，并出现低胆固醇血症〔18〕。

3.2 PCSK9功能获得型突变与高胆固醇血症 PCSK9功能获得型突变可增强PCSK9降解LDLR的能力，从而使血浆LDLC显著升高，导致常染色体显性高胆固醇血症(ADH)或家族性高胆固醇血症(FH)。主要突变形式有 D129G、S127R、R496W、C(-161)T、R218S、1474V、F216L、D374Y、N425S、H553R和 E670G 等〔17〕。

研究发现，在ADH的患者中12.5%的人有PCSK9的突变。Abifadel等〔19〕对法国的23个ADH家系进行鉴定，在排除了LDLR及apoB的突变后的35例发病个体中，发现其中13例发病个体与PCSK9功能获得型突变S127R有关;另外22例个体则与PCSK9的另一功能获得型突变F216L有关。由此可见PCSK9发生这两种突变均可导致ADH。另外，在美国犹他州ADH家族发现D374Y突变;在日本发现了C(-161)T和1474V两个突变〔20〕。在两个突尼斯ADH家族发现，F216L和E670G突变〔21〕，在有上述突变的人群当中，LDL-C的水平均比普通人显著提高。2005年，在美国发现PCSK9的E670G突变和LDLC水平及动脉粥样硬化严重程度有关〔22〕，并因此建议E670G作为血浆高LDL-C水平的独立预测因子。

研究表明，PCSK9功能获得型突变导致高胆固醇血症，可能是通过调节载脂蛋白(apo)B100的分泌及代谢而产生的。apoB100是LDLR的天然配体，负载LDL-C颗粒并与LDLR结合，转运LDL-C进入肝细胞进行代谢。野生型小鼠的血浆PCSK9在不依赖LDLR的情况下，可显著上调apoB100的表达〔8〕，而 PCSK9-/-小鼠的血浆 apoB100，apoE48水平却明显下降〔14〕。Ouguerram等〔23〕通过对2例携带PCSK9 S127R突变的ADH患者的研究发现，PCSK9突变体S127R可引起apoB100表达增高。体内试验表明〔24〕，在有S127R突变患者中，血浆LDL升高，apoB100合成增多。在PCSK9过表达的小鼠模型和细胞中，PCSK9的存在并不能改变VLDL apoB的合成及分泌。然而S127R突变患者却可导致VLDL apoB的升高。后续研究〔23〕还发现，PCSK9的S127R突变组中，apoB100明显增高，而且升高的apoB100源于VLDL、IDL、LDL的生成过多。在D374Y突变引起的ADH患者与LDLR或apoB100突变引起的ADH患者相比，使用他汀类药前后，胆固醇水平更高〔23〕。

4 PCSK9的其他功能

PCSK9除了可以影响体内脂质代谢外，还涉及其他许多生物过程。譬如PCSK9可促进肝脏发育、再生、促进神经系统发育、影响神经系统分化并且与糖尿病相关。PCSK9还可通过降解脂肪组织的VLDLR，限制内脏的脂肪生成〔25〕。研究表明，PCSK9能够降低鼠肝细胞表面丙型肝炎病毒的受体 CD81的表达，调节丙型肝炎病毒的感染〔26〕。研究还发现，PCSK9基因的过度表达导致包括细胞周期、细胞凋亡、炎症和应急反应等多种途径的失调〔27，28〕。而PCSK9基因缺失对肿瘤的转移可起到一定的保护作用〔29〕。

5 展望

由于PCSK9可介导LDLR降解，升高LDL-C水平，增加高脂血症及动脉粥样硬化等心脑血管疾病的患病风险，研发针对PCSK9的药物，抑制PCSK9的表达或阻断其降价LDLR的作用成为治疗动脉粥样硬化、ADH的新思路。比如:PCSK9合成分泌需自身催化反应，采用自身催化特异敏感小分子抑制剂可抑制活性PCSK9生成;利用小分子抑制剂阻断PCSK9、LDLR作用，干扰二者结合;运用反义技术可能抑制人体肝脏PCSK9功能;针对PCSK9、LDLR复合物的抗体疗法等均是可考虑的策略。PCSK9与脂质代谢更广泛的联系及其作用机制尚待深入研究。

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