大豆异黄酮抗氧化作用与脑缺血防治

王龙梓(淄博职业学院药学系，山东　淄博　255314)

大豆异黄酮抗氧化作用与脑缺血防治

王龙梓
(淄博职业学院药学系，山东淄博255314)

〔关键词〕大豆异黄酮;雌激素;氧化应激;超氧化物歧化酶(SOD) ;脑缺血

第一作者:王龙梓(1976-)，男，医学硕士，讲师，医师，主要从事心脑血管药理学研究。

大豆异黄酮(SI)主要活性成分有染料木黄酮(GEN)，大豆黄素(DAI)，黄豆黄素(GLY)等，大部分与糖结合以糖苷形式存在。大量研究显示，SI对人类有多种益处:调节血脂从而降低冠心病发生风险，防治骨质疏松，防治恶性肿瘤及神经保护作用等〔1，2〕。SI能够与雌激素受体(ER)结合，具有弱的雌激素活性，被称为植物雌激素。近年来发现DAI的体内代谢产物雌马酚的亲和力和雌激素样生物活性均较DAI强，受到学者的关注〔3〕。目前，SI作为保健食品已用于女性更年期疾病如绝经后骨质疏松等。氧化损伤是脑缺血损伤的关键因素，而SI的抗氧化作用是SI产生脑缺血损伤保护作用的主要因素。SI在脑缺血损伤中可发挥直接抗氧化作用抑制过氧化物的产生;也可发挥间接抗氧化作用抑制促氧化酶如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶(NOX)的活性，增加抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)的活性等。本文对SI的抗氧化作用特点及其通过抗氧化产生脑缺血保护作用及机制的研究进展进行综述。

1　SI的抗氧化作用

Oh等〔4〕给予去卵巢雌性SD大鼠喂养SI 12 w，同时给予或不给予运动锻炼。12 w后发现不管是否给予大鼠运动锻炼，给予SI均能明显增强血浆三价铁还原能力(FRAP)，增加血浆谷胱甘肽(GSH)含量。提示SI对绝经后的氧化应激具有防治作用。有学者〔5〕检测了SI在人体的抗氧化作用: SI添加剂80 mg/d给予9个绝经后妇女和13个年轻妇女6个月，然后停止应用14个月。允许受试者消费他们正常的食品。分别于开始研究后2、4、6个月和停止应用后的第8个月和第14个月采集血样，检测血浆GEN和DAI浓度，总抗氧化能力，氧化应激标记等。开始研究后第4个月的统计分析结果显示，在包括绝经妇女和年轻妇女在内的受试者中SI血浆浓度明显升高，血浆总抗氧化能力明显增强，氧化应激标记如红细胞膜流动性和红细胞O-β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)活性增强，淋巴细胞DNA的氧化破坏明显降低。以后恢复到基础水平。DNA的破坏和血浆SI水平呈明显的负相关。研究结果显示SI添加剂对抗女性体内氧化应激的有效作用，提示消费大豆食品对人类健康的益处部分与SI的抗氧化作用有关〔5〕。SI的抗氧化作用不仅表现在雌性个体。Barbosa等〔6〕将含SI的大豆蛋白，不含SI的大豆蛋白分组喂养Wistar雄性大鼠，剂量为SI每天1 mg/ 200 g体重，SI各组浓度相同。此方式喂养大鼠30 d后检测大鼠血和组织器官抗氧化能力发现: SI和大豆蛋白均能增强SOD活性，仅SI而不是大豆蛋白降低血浆硫巴比妥酸反应物(TBARS)水平，增强血浆抗氧化能力，增强红细胞GSH过氧化物酶(GSH-Px)活性。

体外研究亦显示SI有效的抗氧化作用及复杂的抗氧化作用机制。大豆中提取的异黄酮类物质可通过增强一氧化氮(NO)合酶的活性，抑制过氧化氢(H2O2)诱导的人脐静脉内皮细胞(ECV304)的氧化损伤〔7〕。Xu等〔8〕体外实验研究显示，GEN和DAI可抑制H2O2诱导的ECV304损伤，这种保护作用可被ERβ拮抗剂阻断;同时，GEN和DAI也抑制低糖条件下氧化应激诱导的细胞增殖，抑制调节细胞凋亡基因Bcl-2的表达可阻断这种作用;而且，应用渥曼青霉素抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和Rho/A/Rho激酶通路可改变GEN和DAI维持培养细胞氧化应激下存活的作用。上述研究〔7，8〕提示SI可通过调节ERβ、Bcl-2/Bax的基因表达、调节细胞生存信号等多种途径保护氧化应激诱导的内皮细胞损伤。

2　SI通过抗氧化作用保护脑缺血损伤

2.1X脑缺血损伤与氧化应激大量研究〔9～11〕提示脑缺血损伤为主要的几个关键病理因素相互作用的结果，包括氧化应激，钙离子失平衡，线粒体功能异常，炎症等因素。脑缺血和再灌注后，氧自由基大量生成，氧化应激在脑缺血损伤中起关键作用。几种氧自由基和其衍生物在脑卒中后产生，包括超氧阴离子和羟自由基(·OH)等。氧自由基能与NO反应产生过氧化物(ONOO－)，这是一种强的氧自由基，导致蛋白质硝化和功能失常。上述氧化剂除了氧化大分子导致细胞损伤，也参与细胞生存死亡途径和导致线粒体功能失常〔9〕。氧自由基的产量能通过体内氢化水电乙叉基(HEt)检测来评价。细胞内HEt被氧化和转换为乙叉基(Et)，在生理条件下，Et信号被作为细胞质内微粒检测，体现了线粒体内的产量。在局灶性缺血区再灌注4 h后，神经细胞内一种散开模式的Et荧光信号提示广泛和大量的在细胞质内产生〔10〕。而且，全脑缺血使大鼠表现为迟发型细胞死亡的海马CA1区 Et信号增强。提示氧化应激在脑缺血迟发型神经细胞死亡中起重要作用〔11〕。

2.2SI通过抗氧化作用保护脑缺血损伤研究资料显示，多酚类化合物可通过抗氧化作用，抑制脑缺血后损伤和线粒体功能失常导致的脑水肿和细胞肿胀，从而产生脑保护作用〔12〕。血清雌激素剂量在生理水平时具有脑保护作用，间接抗氧化作用是雌激素发挥脑缺血保护作用的主要机制之一〔13〕。SI可以通过抗氧化机制产生脑缺血保护作用。

研究显示，雌性SD大鼠去卵巢后喂养含SI大豆食品2 w，行持续性局灶性脑缺血24 h后大鼠脑梗死面积明显缩小，提示含SI大豆食品长期预防性给予可保护脑缺血损伤〔14〕。药理干预研究中，Wistar大鼠饲养时均为无大豆饮食，给予大鼠脑缺血90 min，后实现再灌注。于脑缺血再灌注30 min后给予GEN每天1 mg/kg腹腔注射。再灌注3 d后wistar大鼠脑梗死面积与对照组相比明显减小，而WKY大鼠和自发高血压大鼠脑梗死面积与对照组相比无明显减小。提示SI的主要活性成分GEN治疗给药具有脑缺血保护作用，但依赖于实验动物的品系; GEN治疗给药可减轻Wistar大鼠缺血脑组织实现血管再通后的脑损伤〔15〕。

SI的抗氧化作用机制既有抑制氧化应激的直接抗氧化作用，也有通过影响体内抗氧化物质如SOD和体内促氧化物质如NOX的间接抗氧化作用。有学者〔16〕系统地研究了SI通过抗氧化作用保护大鼠脑缺血损伤。雄性和雌性去卵巢SD大鼠去SI饮食1 w后，在异氟烷麻醉下行局灶性脑缺血90 min，实现再灌注后，分组饲养去SI食物或添加GEN 500/10^(500 ppm)食物或添加雌马酚(250 ppm)食物2 w。再灌注24 h确定氧化应激指标，再灌注3 d后评价脑损伤情况。结果显示，与无SI组相比，食用GEN和DAI的雄性和雌性大鼠脑梗死体积明显减小，雌雄无明显差别。与Barbosa等〔6〕研究不同的是，GEN不能明显降低血浆巴比妥酸反应物(TBARS)水平。但雌马酚治疗组血浆TBARS水平明显降低，提示雌马酚比GEN抗氧化作用强。GEN和雌马酚均能明显降低雌性去卵巢大鼠脑组织过氧化物水平和NOX活性，而且之间无明显差别。雌马酚和GEN促进大鼠脑组织两种抗氧化基因的表达。分别是DNA修复基因Ercc2和保护细胞免受氧化应激损伤的一种雌激素敏感酶Nqo1。雌马酚和GEN对脑组织NOX活性影响与对NOX复合体gp91phox和p22亚基蛋白表达的影响无关。提示雌马酚和GEN主要影响脑组织NOX的活性。虽然雌马酚和GEN对脑组织SOD蛋白水平和过氧化物酶水平未见影响，但没有测定SOD的活性〔16〕。Barbosa等〔6〕研究显示，SI长期应用可增强大鼠血浆SOD活性。雄性糖尿病大鼠给予4 w，每天1 mg/kg的GEN后使主动脉SOD活性得到一定程度恢复〔17〕。

体外实验研究检测了3种大豆植物雌激素GEN，DAI和DAI的代谢物雌马酚对受到体外缺血样损伤的幼年大鼠前脑皮质神经细胞的作用，剂量为SI在人类血循环中的有效浓度(0.1～1 μmol/L)。预先给予3种植物雌激素均抑制暴露于谷氨酸毒性或钙离子依赖的三磷酸腺苷(ATP)酶抑制剂毒胡萝卜素之下的细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)。事先用3种植物雌激素治疗的暴露于组织缺氧或氧剥夺损伤(OGD)的细胞通过ER依赖机制抑制细胞死亡。虽然OGD导致多种模式的细胞死亡，但是通过检查和Caspase-3活性来看，大豆植物雌激素可抑制此模型的细胞凋亡。此外，阻断PI3K抑制GEN和DAI的保护作用，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制GEN依赖的神经保护作用。实验结果提示饮食水平的大豆植物雌激素能发挥雌激素样神经保护作用〔18〕。

2.3SI促进脑缺血损伤的可能性SI和雌激素均具有明显的抗氧化作用，但雌激素长期应用副作用大，缺乏孕激素时会明显增加癌症的发生风险。研究显示，血清雌激素水平在生理剂量时具有脑保护作用，而超生理水平促进脑缺血损伤〔13〕。与此相似，大豆植物雌激素长期应用也有促进脑缺血损伤的可能。如DAI的代谢产物雌马酚虽然比GEN和DAI抗氧化作用强，但是最近研究提示小鼠长期食用雌马酚产生促进氧化的作用〔19〕。虽然低剂量雌马酚喂养小鼠3 w后可抑制过氧化物的产生，增加H2O2酶和SOD的活性产生抗氧化作用，但是高剂量雌马酚长期应用增加TBARS水平，过氧化氢酶(CAT)和SOD的活性受到抑制，通过促进p53基因的表达促进小鼠脑细胞凋亡。提示高剂量雌马酚尤其是长期应用通过促进氧化的作用损伤小鼠脑组织。SI的其他活性形式如GEN等则未见体内长期应用产生促氧化作用的研究。有研究显示大鼠长期单独应用GEN时，体内5和10 μmol/L浓度的SI水平几乎无副作用，但无人体长期安全性证据〔20〕。需进一步研究SI的慢性毒性考察其促进脑缺血损伤的可能性。

3　SI通过抗氧化机制产生脑缺血保护作用研究前景

氧化损伤是脑缺血和再灌注损伤后级联损伤反应的关键因素，SI的脑缺血保护作用与其抗氧化作用密切相关，而SI的抗氧化作用与其增强抗氧化酶SOD的活性，抑制NOX的活性密切相关。虽然氧化应激是脑缺血再关注损伤的主要原因之一已经被前期研究证实，但是抗氧化剂实现对临床缺血脑卒中病人的有效治疗似乎仍然遥遥无期。应用于脑缺血保护的药物如抗氧化剂临床试验均宣告失败。脑缺血病理生理机制的研究进展较大，但治疗手段很有限。仅仅重组组织纤溶酶原激活物的溶栓治疗作为有效的治疗方法。其治疗时间窗有限，且有出血风险和潜在的缺血再灌注损伤风险〔21〕。笔者认为，发现临床有效的脑缺血保护药不仅应该继续深入探索脑缺血过程的病理生理机制，而且应该进一步改进脑缺血保护药临床疗效评价方法。此外，应该继续深入探讨脑缺血保护药治疗的时间窗来评价此类药物的有效性和作用特点。

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〔2013-12-30修回〕

(编辑杜娟)

〔中图分类号〕R743

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2015) 15-4385-03;

doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2015.05.131