人脐带间充质干细胞移植治疗血管性痴呆的可能性



人脐带间充质干细胞移植治疗血管性痴呆的可能性

何燕王俊魏云鸿金醒昉

(昆明医科大学附属延安医院，云南昆明650051)

关键词〔〕间充质干细胞;细胞移植;血管性痴呆

第一作者：何燕(1980-)，女，硕士，副主任医师，主要从事心脑血管病研究。

我国老年性痴呆中血管性痴呆(VD)占第二位，在脑卒中患者中VD的患病率为12%～36.3%〔1〕。间充质干细胞(MSCs)存在于全身结缔组织和器官间质中。人脐带MSCs(HUC-MSCs)成功克服了骨髓MSCs含量低、受年龄影响大等诸多限制，而且具有来源广泛、免疫原性低等优点。HUC-MSCs在组织工程、神经系统、肝脏疾病、心血管系统、免疫疾病、肿瘤疾病等方面取得了巨大的进展。已有多项研究表明，体外培养的HUC-MSCs可向神经细胞方向分化〔2，3〕，且HUC-MSCs移植治疗脑卒中的动物实验研究也取得了可喜的成果〔4〕。因此，HUC-MSCs有可能用于VD的治疗。

1VD的发病机制

VD是由脑血管因素导致脑组织损害引起的痴呆综合征，其确切发病机制尚不明确。目前较为明确的机制有如下几个方面：①胆碱能传导通路受损：VD的记忆功能障碍与中枢胆碱能系统有着必然的联系，大鼠缺血再灌注后乙酰胆碱(Ach)浓度下降，同时给予拟胆碱能药物能改善学习记忆功能。许多研究证明，记忆突触即为胆碱能突触，胆碱能神经通路本身即参与构成记忆痕迹隔阂-海马的传导通路与空间识别、工作记忆有关，大细胞基底核-大脑皮质的传导通路与学习过程的调制、参照记忆有关。VD大鼠脑组织Ach合成酶(ACHE)活性明显升高〔5〕。胆碱乙酰转移酶(CHAT)免疫组化表明，海马CA1区CHAT免疫反应阳性神经元和纤维数量明显减少，与大鼠的学习记忆障碍程度呈正相关。这些部位的损伤可导致皮质、海马及大细胞基底核细胞萎缩，胆碱能传导通路受损，从而引起胆碱能缺陷和学习记忆功能障碍〔6，7〕。②神经细胞凋亡：现有研究表明，在脑组织缺血早期，由于脑缺血过度激活谷氨酸受体，导致细胞内的Ca2+超载、自由基数目增加、细胞内的线粒体损伤受损，出现神经元和胶质细胞的凋亡〔8〕。尤其是海马CA1区神经元和纤维数量明显减少可严重影响记忆功能。③氧自由基：脑缺血再灌注的急性期可产生大量的自由基，自由基的连锁反应主要攻击灰质的神经元等富含脂质的脑细胞，引起磷脂破坏降解从而发生变性失能，使细胞膜的通透性大大增加，从而发生了细胞的毒性水肿，兴奋性递质释放。自由基由于连锁反应而发生的急速蓄积，进一步攻击其他细胞的生物膜结构，造成神经细胞的坏死，半暗带区进一步恶化，梗死范围迅速扩展。④炎性机制：急性脑缺血后，在继发性神经损伤中起主要作用的是炎性反应，其中白细胞介素(IL)-1β和炎性细胞因子可引起缺血再灌注中炎性反应，其局部表达最为突出。脑缺血和再灌注时，内皮细胞、神经元等在局部被激活，通过释放两种关键的炎性因子肿瘤细胞坏死因子(TNF)-α和IL-1β触发炎症反应，引起其他细胞因子与炎性代谢产物一起促使白细胞迁移至组织损伤区，导致血管再闭塞，引发“无再流”现象白细胞还可以产生蛋白水解酶和其他效应分子，引起神经元的直接损伤，提示炎性机制可能在VD的发病机制中起重要作用。

由此可见，VD既有脑血管病的病理学改变和胆碱能神经元的坏死，又有神经生化机制的受损，而目前认为，干细胞一方面可以在受损的组织中生成新的功能细胞，另一方面，还可以分泌多种神经营养因子(NT)、免疫调节因子及营养分子以对损伤组织进行修复。

2UC-MSCs治疗VD的优势

Romanov等〔9〕从脐静脉内皮下层成功分离出MSCs。研究表明，脐带中富含造血、间充质及内皮等多种干/祖细胞，其中MSCs可来源于脐带华尔通胶，脐血管周围，脐静脉血管内皮下和脐血(新鲜脐血单核细胞中可分离20%～50%的MSCs)〔10〕。HUC-MSCs的优势在于：①脐带是胎儿的附属物，取材方便，来源广泛，易于收集、冷冻、保存；②从脐带华尔通胶中提取的MSC取材方便，相对纯净，致瘤性和病毒、细菌污染可能性均较骨髓干细胞低；③不表达或低表达免疫排斥相关标记，免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，在临床应用上还避免了胚胎干细胞的伦理争议；④UC-MSCs含量丰富，原代培养即可获取大量细胞，其分化潜能介于胚胎干细胞和成体干细胞之间，既不会发生自发分化又不会无限增殖而形成畸胎瘤，又易于分化为 3个胚层衍生的多种成熟细胞；⑤与骨髓MSCs相比，不会随着传代次数增加和机体年龄增长导致增殖能力和分化能力降低〔11〕。因此，HUC-MSCs已被当做是临床和科研工作中MSCs的一个更佳来源。

3UC-MSCs向神经干细胞的转化

UC-MSCs具有较强的可塑性，能发育成多种不同的细胞，成为人MSCs的重要来源。实验〔2〕证明，HUC-MSCs可以诱导为神经细胞和神经胶质细胞。Mitchell等〔12〕先以碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预处理过夜，再以多种化学诱导剂进行诱导，结果发现大部分细胞转变成神经元样细胞，并高水平地表达神经元标志物β-Ⅲ型微管蛋白和神经微丝。Fu等〔2〕以神经元条件培养基进行诱导，第3天时可见细胞发生形态学改变并开始表达神经元抗核抗体和神经微丝；第6天时开始表达红藻氨酸盐受体和谷氨酸脱羧酶；第9～12天时神经微丝的表达水平进一步上升并可检测到谷氨酸诱发的内向电流，表明这时的细胞已转化为成熟神经元。Ding等〔3〕发现以bFGF、β-巯基乙醇、NT-3、神经生长因子和脑源性NT(BDNF)对克隆扩增的UC-MSCs进行诱导后约60%的细胞可表达微管相关蛋白-2，32%表达胶质纤维酸性蛋白。Koh等〔13〕对将UC-MSCs进行体外诱导后发现，约有(77.4±17.8)%的细胞表达神经元特异性标志物如β-Ⅲ型微管蛋白、酪氨酸激酶受体、神经元核抗原和神经微丝-M，而表达星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞标志物半乳糖脑苷脂的细胞数目则不足10%。Karahuseyinoglu等〔14〕则认为人脐带基质细胞中的扁平、粗大的1型细胞对神经诱导分化方案基本无反应，而成纤维细胞样的2型细胞可被诱导分化为神经元。此外，研究表明，HUC-MSCs不仅可分化为神经元和胶质细胞，还可分化为特定类型的神经元细胞。Fu等〔15〕以神经元条件培养基和成纤维细胞生长因子(FGF)-8成功地将HUC-MSCs诱导为表达酪氨酸羟化酶并分泌多巴胺的多巴胺能神经元。此外，Weiss等〔16〕还成功地将其诱导为表达酪氨酸羟化酶的胆碱能神经元。

4UC-MSCs治疗VD的可能性

脑血管病、颈部血管病变、血流动力学改变等多种病因引起大脑长期低灌注，导致大脑神经细胞物质和能量代谢紊乱，促使脑部神经元发生不同程度的损伤或丢失或者由于出血导致的脑实质损伤而引起认知功能损害是VD发生的核心机制。但HUC-MSCs治疗神经系统疾病尚处于起步阶段，动物实验证明移植HUC-MSCs有助于促进创伤性脑损伤后的早期功能恢复〔17〕，可改善帕金森病、脊髓损伤、脑卒中后遗症〔18〕。目前国内外尚未见到其治疗VD的临床研究。HUC-MSCs在VD患者脑内能否存活并分化为胆碱能神经元或增加胆碱能神经元的含量及改善局部缺血脑组织的血供，成为众多学者关注的问题。通过以上研究已经证明，HUC-MSCs内含有可向神经细胞方向分化的干细胞，并且其用于缺血性脑血管病动脉模型的治疗也被证明有效。因此，HUC-MSCs可能成为治疗VD的新方法，其治疗VD的可能机制包括以下几个方面：

4.1细胞替代作用UC-MSCs具有多向分化潜能，可向神经细胞系多种细胞转化，具有神经干细胞或神经前体细胞特性。在合适的诱导条件下，神经干细胞或神经前体细胞可分化为胆碱能细胞〔16〕。如果将UC-MSCs移植到VD患者脑内，部分细胞有可能向胆碱能细胞分化，从而发挥细胞替代治疗作用，改善VD患者的症状。

4.2神经营养支持和抑制凋亡作用神经损伤后，在神经元与靶细胞建立正确的联系过程中，保持神经元的存活及轴突的延伸，必须获得营养的支持才能得以实现。而NT在神经生长中起着重要的营养支持作用。实验研究证实HUC-MSCs具有丰富的分泌功能，可分泌多种促血管因子和神经营养因子。Lin等〔19〕发现，移植于脑缺血模型的MSCs能产生bFGF等NT，促进动物的神经功能恢复和减轻缺血再灌注损伤。何远东等〔20〕通过流式细胞仪检测HUC-MSCs的神经营养因子谱，发现与神经营养相关的因子BDNF、表皮生长因子(EGF)、胶源NT(GDNF)、NT-3、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)-1、NT-4在HUC-MSCs中均有表达，进一步验证了HUC-MSCs通过分泌NT治疗神经损伤的作用。此外，HUC-MSCs还有抑制神经细胞凋亡的作用，袁源等〔17〕实验发现，将HUC-MSCs移植后1～3 w，动物神经功能评分较对照组明显改善；4 w后，各组动物神经功能评分均恢复正常。免疫组织化学检测表明少部分移植细胞表达神经元特异性烯醇化酶，胶质纤维酸性蛋白。与对照组相比，移植组损伤区VEGF表达明显增加，凋亡细胞减少，促进神经功能恢复。

4.3 促进血管生成，改善局部血流的供应HUC-MSCs移植到脑缺血大鼠损伤局部，发现干细胞广泛参与到血管壁中，参与血管的形成，免疫学染色还发现，部分MSCs表达血管内皮细胞特异性蛋白血管性血友病因子(vWF)〔4〕。MSCs的成血管能力在其他的缺血模型如心梗、下肢缺血中也得到了证实〔21，22〕。此外，MSCs本身可以通过旁分泌作用促进血管的增生，MSCs不仅能分泌VEGF、bFGF、肝细胞生长因子(HGF)等促血管新生的活性因子，还可以分泌血管新生所需要的细胞外基质成分如整合素、钙黏素等，从而参与血管的生成〔23〕。Liao等〔4〕研究还证明了，HUC-MSCs有助于促进脑缺血大鼠损伤神经早期功能恢复，这种治疗效果是通过刺激宿主细胞分泌VEGF，增加损伤区微血管密度来实现的。

4.4抑制炎症反应和免疫调节作用研究发现，HUC-MSCs的移植可以减轻损伤后组织的炎症反应，包括抑制白细胞的浸润和小胶质细胞的激活，下调活性氧簇和炎症因子的分泌从而减轻神经损伤。MSCs在免疫方面具有非常特殊的作用，除了本身低免疫源性外，MSCs还能调节免疫系统，发挥免疫抑制和抗炎的作用〔24，25〕。MSCs可以抑制树突细胞迁移与成熟，使树突细胞保持在不成熟状态或成熟异常；MSC和淋巴细胞混合培养后，可以下调干扰素(IFN)-γ、IL-2、TNF-α等促炎因子，从而抑制T淋巴细胞的增殖，MSC还可以抑制原始T细胞和记忆T细胞，抑制淋巴细胞生长因子IL-2及其受体的表达、抑制T细胞表面共刺激因子CD80、CD86的表达而使T细胞无能〔26〕。

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〔2015-01-15修回〕

(编辑杜娟)

通讯作者：金醒昉(1962-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事老年病研究。

基金项目：云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项基金资助(No.2011FB233)

中图分类号〔〕R741.05〔

文献标识码〕A〔

文章编号〕1005-9202(2015)23-6945-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.23.138