山茱萸多糖提取纯化方法及药理作用研究进展

山茱萸多糖提取纯化方法及药理作用研究进展

杨雪季红1刘颖男2张玉成2

(吉林大学中日联谊医院妇产科，吉林长春130033)

关键词〔〕山茱萸多糖；衰老；抗氧化

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省中医药管理局(08SYS-091，2010-pt050)

通讯作者：张玉成(1978-)，男，博士，医师，主要从事肿瘤基因诊断、治疗及衰老机制研究。

1吉林大学中日联谊医院药品管理部

2吉林大学中日联谊医院中心研究室

第一作者：杨雪(1984-)，女，硕士，主治医师，主要从事围生医学研究。

山茱萸又叫石枣、药枣，为山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)干燥成熟果肉，具有补益肝肾、涩精固脱的功效。本文着重就山茱萸多糖的提取纯化方法及山茱萸多糖的药理作用作一综述。

1山茱萸多糖的提取纯化方法及最佳的提取工艺

1.1传统提取纯化方法主要采取热水、超声和乙醇沉淀等。李平等〔1〕将热水抽提后的山茱萸残渣用碱提取后，经过中和、浓缩、透析、沉淀，然后再经过分离和纯化，得到白色粉末状多糖PFCCⅠ，最终证明PFCCⅠ是由木糖和葡萄糖以18.8∶81.2摩尔比组成，平均相对分子质量为7.57×104kD。同时该研究者〔2〕用热水抽提、Sevag法脱蛋白、沉淀、分离，最后再通过纯化，最终得到白色粉末状多糖PFCA Ⅲ。陈汝贤等〔3〕同样用热水来提取，去除杂质后经过乙醇沉淀，利用小型超滤/过滤系统及两种柱色谱进行分离，最终得到多糖组分SZYP-2。赵晓华〔4〕分别应用超声和热水两种方法提取山茱萸多糖并进行纯化，具体方法如下：热水(超声)提取，乙醇沉淀，Sevag法除蛋白，经过分离纯化后，最终得到2种纯化多糖S2(超声提取)和F4(热水提取)。杨云等〔5〕也采用热水提取，乙醇沉淀，采用了三氯醋酸除蛋白得到粗多糖，经过分离和纯化后，高效凝胶渗透色谱鉴定纯度并测定分子量等步骤后，最终分离得到一水溶性多糖Co-4，其分子量为2.47×104kD。赵莉等〔6〕采用水抽提，乙醇沉淀，柱层析等方法从山茱萸果实中分离出两类多糖，分别为非淀粉类中性糖和酸性多糖，含量分别为7.4%和1.1%。

1.2提取工艺条件张彩莹等〔7〕研究发现在温度为100℃、时间为3 h、料液比为1：36的条件下，最终山茱萸多糖提取率为199.36 mg/g。赵晓华等〔8〕研究确定了山茱萸多糖的最佳提取工艺，在温度为80℃、料液比为1∶60、时间为300 min的条件下，最终山茱萸多糖提取率为13.8 %。李平等〔9〕研究也确定了山茱萸多糖最佳提取工艺，该研究发现在温度为80 ℃、时间为2 h、料液比为1∶16的条件下，同时原材料粒度采用300～450 μm，提取次数4次，脱蛋白次数6次，最终分离得到白色多糖PFCA Ⅲ，该多糖经红外光谱(IR)检测为含有α糖苷键的多糖。

1.3应用微波辅助和复合酶法提取纯化山茱萸多糖以及工艺优化胡园园等〔10〕采用微波辅助技术提取山茱萸多糖，发现在浸泡时间为2 h、微波功率为456 W，材液比为1∶33及微波处理时间为3.2 min的条件下，最终山茱萸多糖提取率为11.12%，从而确定了山茱萸多糖提取的最佳工艺条件。吴艳芳和李豪等〔11，12〕均进行了微波辅助技术提取山茱萸多糖，其中吴艳芳等〔11〕得出的微波辅助提取山茱萸多糖的最佳工艺条件是：料液比为1∶25，微波功率为560 W，微波处理时间为10 min，浸提时间为70 min，最终山茱萸多糖平均提取率为10.53%；李豪等〔12〕发现当应用以下工艺条件山茱萸多糖得率可达20.94%：即山茱萸粉末最佳直径需要在300～450 μm，而料液比1∶19.7，微波功率为624 W，微波处理时间为55 s，水浴温度为90℃，浸提时间为120 min，乙醇体积分数为68.4%。除了微波辅助技术提取山茱萸多糖外，最近又有文献显示应用复合酶法可提取山茱萸多糖。程俊文等〔13〕应用复合酶法提取山茱萸多糖，应用的复合酶包括纤维素酶(2.0%)、果胶酶(2.0%)和中性蛋白酶(1.5%)，最终发现其提取工艺条件为：浸提时间为69 min，浸提温度为50℃，pH值为3.8，此时山茱萸多糖最大提取率可为5.54%。

2山茱萸多糖的药理作用

2.1抗衰老和抗氧化作用目前有关山茱萸多糖研究最多也是最重要的功能就是其具有抗氧化和抗衰老的作用。例如，欧芹课题组〔14~16〕利用50代人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF)作为衰老模型，以加入山茱萸多糖含药血清作为处理因素，研究结果发现山茱萸多糖可降低β-半乳糖苷酶含量、p16蛋白表达阳性细胞数、细胞周期蛋白D1的表达及DNA损伤率，同时可显著提高细胞活力、细胞周期蛋白依赖激酶4及热休克蛋白(HSP)70 mRNA表达，认为山茱萸多糖可能通过以下途径发挥抗HDF细胞衰老的作用，即山茱萸多糖可改变细胞周期调控中的重要因子，如细胞周期蛋白D1、P16和细胞周期蛋白依赖激酶4或者相关的分子伴侣(如HSP70)等；同时金红等〔17〕发现山茱萸多糖(D-gal)能够降低D-半乳糖致衰大鼠脑组织丙二醛(MDA)和脂褐素(LF)含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低单胺氧化酶B(MAO-B)活性及提高小鼠的学习能力等，另外，还发现山茱萸多糖具有降低胆碱酯酶活性和上调神经生长因子的表达〔18〕，山茱萸多糖具有提高机体抗氧化能力，同时上调老化相关酶活性发挥抗脑老化作用，从而提高大鼠学习记忆能力。张玉成等〔19〕以D-gal致衰小鼠作为衰老模型，以加入大小不同剂量的山茱萸多糖作为实验处理因素，结果发现与衰老组小鼠比较，山茱萸多糖大小剂量组均能明显降低一氧化氮自由基、一氧化氮合成酶及白细胞介素(IL)-6，而且能够显著提高IL-1和2，山茱萸多糖可能通过降低一氧化氮自由基，提高机体免疫功能，进而起到延缓衰老的作用；李平等〔1，2，20〕研究发现山茱萸多糖PFCA I、PFCA Ⅲ均能清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，具有抗氧化作用；同时山茱萸多糖能够显著提高衰老小鼠血液SOD、过氧化氢酶(CAT)及谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活力，显著降低血浆、脑匀浆及肝匀浆中过氧化脂质(LOP)水平〔21〕；傅紫琴等〔22〕发现山茱萸粗多糖能显著延长肾阴虚模型小鼠负重游泳时间、耐缺氧时间等。姚运香等〔23〕也发现山茱萸多糖具有补益肝肾的作用；而且能降低肝损伤小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平和肝脏组织中MDA含量，具有保护肝损伤的作用；同时，山茱萸多糖能提高免疫低下小鼠血清溶血素水平，具有提高小鼠免疫力的功能。以上研究均表明山茱萸重要成分山茱萸多糖具有抗衰老和抗氧化的作用。

2.2对免疫功能的影响研究表明山茱萸既具有增强免疫的功能，又具有抑制免疫的功能，而山茱萸多糖主要起免疫兴奋作用。苗明三等〔24〕利用环磷酰胺腹腔注射于小鼠构建免疫抑制小鼠模型，研究发现模型小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能、溶血素形成、溶血素空斑和淋巴细胞转化能力均低于正常小鼠，而应用山茱萸多糖后，均可显著提高以上指标。杜伟峰等〔25〕利用相同方法构建免疫抑制模型，发现免疫低下模型小鼠无论是体液免疫、细胞免疫还是非特异性免疫等比正常小鼠有所降低，而应用山茱萸制品多糖后明显改善以上指标。以上研究均表明山茱萸多糖具有提高免疫的作用。

2.3改善骨髓造血杨东旭等〔26〕等利用化疗药物环磷酰胺腹腔注射于小鼠体内，10 d后检测发现小鼠白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白浓度均有所降低，同时降低的指标还有脾脏指数、骨髓细胞数和DNA含量；如果同时应用山茱萸多糖作为处理因素，能够明显提高白细胞、红细胞、血小板和血红蛋白浓度及DNA含量和骨髓有核细胞数。因此山茱萸多糖可能通过改善骨髓造血，进而促进各种血细胞的恢复。

2.4对肿瘤细胞的影响现代医学研究表明山茱萸多糖具有抑制肿瘤细胞的作用。邹品文等〔27〕发现山茱萸多糖在体外明显抑制S180肉瘤细胞的生长，同时也发现山茱萸多糖在体内能提高荷S180瘤细胞的小鼠外周血CD4+T细胞表达，而降低CD8+T细胞表达，提高IL-2、降低IL-4水平。王恩军等〔28~31〕应用山茱萸多糖作用于人宫颈癌HeLa细胞和肺癌A549细胞，山茱萸多糖能够显著抑制Hela和A549细胞的生长，并能够促进细胞凋亡，其机制可能是山茱萸多糖通过降低Survivin和Bcl-2及上调Bax表达有关。

山茱萸应用有着悠久历史，其作用广泛，《本草纲目》记载山茱萸具有“强阴益精，安五脏，通九窍，止小便利。久服，明目强身延年。治脑骨痛，疗耳鸣，补肾气，兴阳道，坚阴茎，添精髓，止老人尿不节”。山茱萸具有调节免疫、降低血糖、抗炎抑菌、抗衰老、抗心律失常及抗癌等功效。山茱萸成分多而复杂，主要包括糖类、苷类、有机酸及其酯类、鞣质类及微量元素等。目前关于其重要成分山茱萸多糖的研究越来越多，其药理作用主要包括提高免疫、抗炎、抗衰老和抗氧化、提高骨髓造血及抗肿瘤细胞作用，需进一步揭示山茱萸多糖药理作用及机制。

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〔2014-02-19修回〕

(编辑赵慧玲/张慧)