猪圆环病毒2型复制与转录模式研究进展

王伟丞，梁海英，曾智勇，汤德元，刘 钊,代振江

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型复制与转录模式研究进展

王伟丞，梁海英，曾智勇*，汤德元，刘 钊,代振江

（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒是一种单股负链环状DNA病毒，有PCV1和PCV2两种血清型，PCV1一般认为无致病性，而PCV2是导致断奶仔猪多系统衰竭综合症的重要病原，给养猪业造成了巨大的经济损失。PCV复制模式为坩埚滚环复制，须依赖于Rep和Rep，蛋白的共表达、病毒复制起始区和双链DNA片段的形成，三者缺一不可；其转录模式也较为复杂，可双向进行且通过选择性剪切从而产生不同的RNA。主要对PCV2复制模式和转录模式等方面进行综述，以期为PCV的相关研究提供借鉴和参考。

猪圆环病毒；基因组结构；复制模式；转录模式

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属，是一种非常小的无囊膜的单股环状负链DNA病毒。1974年由Tisher等在PK-15细胞中首次发现猪圆环病毒1型（PCV1）[1]，其在猪群中广泛存在，一般认为无致病性，但Saha等研究表明PCV1对猪的胚胎有一定致病性[2]。1991年，在加拿大从断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的患猪中分离到一种新病毒，该病毒与PCV1非常类似，但在抗原和基因上存在较大差异，因此被称为猪圆环病毒2型（PCV2）[3]。PCV2引起的各种疾病给世界养猪业造成巨大的经济损失，受到国内外学者的高度重视。目前，该病在世界范围内流行，死亡率在10%～30%不等，现已被世界各国的兽医和养猪业者公认为本病是继猪繁殖与呼吸综合征之后新发现的重要猪传染病[4]。本文就PCV2近年来复制与转录模式相关研究进行了综述。

1  PCV2复制模式研究

PCV的基因组以坩埚滚环模式进行复制。在复制过程中，病毒首先产生双链(DS)的复制型中间体(RF)。该复制型中间体DNA的2条链都能进行基因转录和蛋白质的表达。PCV2的复制起始区含有1个发夹结构和1个保守的八核苷酸基序A1X2T3A4X5T6↓A7C8（↓为缺口切割位点），这2个结构是病毒滚环复制过程中病毒正链合成的起点[5]。研究证实，PCV2的复制起始区位于一个324 bp的片段上，该片断位于PCV2基因组的1 635～195 bp处，在PCV2的复制起始区包含1个茎环结构、保守的八核苷酸基序、3个六核苷酸重复序列(CGGCAG)和2个五核苷酸重复序列，Rep和Rep’的共表达同样也是起始PCV2的复制所必须的，单独的PCV2 Rep和Rep’也不能起始PCV2的复制。用突变法对PCV2的保守八核苷酸基序进行研究表明，PCV2复制起点的八核苷酸基序是病毒蛋白合成、DNA复制和子代病毒稳定产生的必需核心元件[6]。滚环复制模型一般如下：

1.1 单链DNA变为双链DNA

单链 DNA病毒基因组变成双链中间体并形成超螺旋作为病毒 DNA 合成的模板。这种机制和细菌质粒复制相似，已经证明只有超螺旋分子能够作为RCR起始的模板。单链变成双链基因组需要负链引物来起始新生互补链DNA的合成。在双粒病毒和纳米病毒中，负链引物由DNA或者是包装在病毒中的5’端有几个核糖核酸组成，或者是病毒感染后宿主细胞中合成的一个RNA引物。这些引物位于复制起始区或者终止序列基因间区域。但PCV负链基因组引物还没有得到证实。

1.2 病毒基因组复制的起始和延伸

PCV基因组的复制要求Rep复合物和顺式作用元件，在复制起始位点相互作用。当Rep复合物结合到Rep和Rep’的最小结合位点上后，使得双链超螺旋构象发生变化，导致环部结构的八核苷酸基序暴露为单链DNA，紧接着被Rep和Rep’蛋白识别并在T6与A7之间切割。一般认为是Rep蛋白而不是Rep’具有解开双链八聚核苷酸的作用，因为Rep蛋白含有1个解旋酶P环结构。T6与A7之间的磷酸二酯键断裂是由Rep蛋白的RC-III中的93位酪氨酸 (Tyrpe)的羟基发起亲核性攻击而导致的，该切割活性依赖于二价阳离子，不依赖于ATP的水解作用或回文序列[7]。在双链被切开后，Rep蛋白通过自身酪氨酸磷脂键结合到DNA链5’末端，由此产生了一个游离的3’—OH末端。接着由宿主的DNA聚合酶以新形成的3’—OH末端作为引物单向起始新DNA合成及延伸。体外研究表明Rep蛋白和Rep’蛋白都能通过酪氨酸残基切割断裂八核苷酸并共价结合到移位的DNA上。现已明确介导切割作用的分子就是共价结合到移位的DNA上，但还没有直接的证据详细说明是Rep蛋白还是Rep’蛋白能够在PCV基因组起始位点结合并介导DNA切割。

新产生的 3’-OH 末端作为第1轮 DNA合成的引物。Rep 和Rep’蛋白都没有聚合酶的作用，初期 DNA的延伸合成是由宿主细胞内酶分子来主导完成的。如果超螺旋构像对PCV基因组复制的起始是必须的，那么处于复制中的基因组将不能起始另一轮DNA的复制，直到第1轮基因组合成完成。

1.3 病毒基因组复制的终止

目前关于PCV前导链合成精确的终止机制还没有确定，现有2种可能的机制。

1）当新生DNA链完全合成及亲本DNA链完全被替代时，Rep蛋白复合物中的Rep’蛋白在模板链T6与新生DNA链的A7之间切割，之后Rep’蛋白共价结合到新生DNA链5’末端，从而形成了亲本链游离的3’-OH末端。这次亲核性攻击导致了亲本环状单链DNA的释放，并形成了带有Rep，蛋白共价结合的新生DNA链。随后新生链的3’-OH末端对含有Rep’蛋白的新生DNA链5’端发起亲核性攻击，从而重新形成八聚核苷酸并释放Rep复合物和含一条新生链的双链复制中间体DNA。利用该机制终止所形成的双链复制中间体DNA分子存在一不相容的回文结构，并永不能再与Rep蛋白复合物共价。

2）如果第1轮DNA合成之后越过切割位点，那么这种终止的机制则与pT181质粒的滚环式复制终止模型相似。在该机制中Rep复合物可能会进行2次分开的切割/连接作用(先是Rep’蛋白再是Rep蛋白)，结果产生一条单链环状亲本DNA，一条含新生链的双链中间体DNA及一含约10～12个核苷酸序列的Rep复合物（SP-Rep 蛋白复合体）。由于Rep蛋白和Rep’蛋白都能在回文序列缺失的情况下执行切割功能，所以在反向重复序列错配情况下，仍然可以进行切割作用，但是释放的亲本单链DNA为线状且与Rep复合物共价结合。由此形成的双链中间体DNA分子还有功能，而且如果新生DNA链恢复了正确的序列配对，那么该双链中间体DNA分子可以在接下来的DNA复制中产生有活力的基因组。该机制可以充分说明含有错配互补重复序列的双链PCV基因组质粒能够产生有活性的子代病毒。

2  PCV2转录模式研究

PCV基因组的转录模式非常复杂。转录是双向进行的并且通过选择性剪切产生不同的RNA。PCV1和PCV2的转录起始和终止信号在基因组上的位置相当，但是它们在特定RNA表达水平及剪切点选择上有所不同。己有报道，在PK-15细胞的病毒复制过程中，PCV1编码13种RNA，包括1个衣壳蛋白 RNA、8个Rep 相关 RNA (分别 为 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c-1、Rep3c-2、Rep3c-3、Rep3c-4)、3个NS相关RNA (分别为NS462、NS642、NS0)及ORF3-RNA；而PCV2编码10个RNA，分别为1个衣壳蛋白RNA、5个Rep相 关 RNA (分 别 为 Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b、Rep3c)、3 个 NS 相关 RNA(分别为NS515、NS672、NS0)及ORF3-RNA，其中Rep相关RNA拥有相同的5’端和3’端核苷酸序列，这可能说明这些RNA是从全长Rep基因中通过选择性剪切而形成的[9]。Rep相关RNA与NS相关RNA的3’端核苷酸序列也相同。通过基因组分析比较发现，PCV1和PCV2的Rep、Rep’、Rep3a、Rep3b和NS0基本上相同，但是Rep3c及NS相关RNA却因剪接点不同而在数量上和性质上有所差别，突变结果表明，Rep和Rep’是病毒复制必须的蛋白。

编码的复制酶蛋白、病毒衣壳蛋白及凋亡相关蛋白功能已进行了鉴定，但这些较小的RNA能否编码蛋白及它们在病毒生命循环中的功能尚不明确。ORF1经不同的剪辑，编码2个病毒复制相关蛋白，Rep和Rep’，Rep和Rep’蛋白与基因间区域5’端复制原点内的特异性序列结合，为病毒复制必需的。ORF2编码病毒的Cap蛋白，与病毒和宿主细胞受体结合有关。Cap蛋白包裹单股环状病毒基因组形成感染性的病毒粒子，并将在复制酶蛋白Rep和Rep’从细胞浆转运到细胞核进行病毒DNA复制起重要作用，PCV2衣壳蛋白是病毒主要的免疫原蛋白，是疫苗研发和PCV2特异性血清学诊断的靶蛋白。此外，ORF3编码的相关蛋白具有一定的致病性，能诱导细胞凋亡[8]。

3  结语

PCV2是严重的免疫抑制性疫病，给养猪业带来了严重的危害。近年来对PCV的复制和转录机理相关研究成为热点，也取得了很多成就，但关于PCV基因组复制过程中Rep’蛋白具体的生物学功能，PCV负链基因组的引物，宿主细胞内的DNA复制相关蛋白如何被激活、记忆、复制、终止的确切机制等仍需深入和系统的研究，以期为抗PCV的药物的开发及疫苗的研制提供更多重要的理论依据。

[1] Tischer I，Rasch R，Tochtermann G.Characterization of papovavirusand picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines [J]. Zentralbl Bakteriol Orig A，1974，226(2)： 153-167.

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[3] Allan G M，Mcneilly F，Kennedy S，et al. Isolation of porcine circoviruslike viruses from pigs with a wasting disease in the USA and Europe [J]. J Vet Diagn Invest，1998，10(1)： 3-10.

[4] 王宪文，姚四新，王丽荣，等. 猪圆环病毒Ⅱ型流行病学新特点及致病机理研究进展[J]. 中国畜牧兽医，2012，39(12)： 190-194.

[5] Cheung A K. Porcine circovirus：Transcription and DNA replication [J]. Virus Res，2012，164(2)：46-53.

[6] Cheung A K.Identification of an octanucleotide motif sequence essential for viral protein，DNA，and progeny virus biosynthesis at the origin of DNA replication of porcine circovirus type 2[J].Virology，2004，324(1)：28-36.

[7] Steinfeldt T，Finsterbusch T，Mankertz A. Functional analysis of cis- and trans-acting replication factors of porcine circovirus type 1[J].J Virol，2007，81(11)：5696-5704.

[8] 李鹏，王利平，朱艳平，等. 猪圆环病毒2型靶细胞及其受体的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40(1)： 25-28.

2014-03-28）

“携带遗传标记的猪圆环病毒反向遗传操作平台的构建”[黔科合LH字（2014）7670]；贵州省农业科技攻关项目“贵州省规模化猪场猪繁殖障碍性疫病防控体系的研究与示范”[黔科NY(2010)3042]

王伟丞（1990—），男，在读硕士，研究方向：动物传染病病原分子生物学。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，硕士生导师，从事动物传染病病原分子生物学研究。