猪细小病毒体外培养研究进展

冯 静 杨 青

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

猪细小病毒体外培养研究进展

冯 静 杨 青*

（湖南农业大学动物医学院，湖南长沙 410128）

猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一。细胞培养法是体外分离纯化病原最基本的方法。本文介绍了病毒细胞模型的建立、细胞模型在病毒诊断中的应用、病毒在细胞培养模型上培养条件的优化等，并分析了病毒与细胞模型相互作用、抗病毒药物在细胞模型上的研究进展。

猪细小病毒 细胞模型 病毒诊断 抗病毒

猪细小病毒（PPV）是造成母猪繁殖障碍的主要因素之一，严重影响母猪的繁殖能力。猪细小病毒感染宿主后，早期引起胚胎死亡，产仔数少或屡配不孕；中期产木乃伊胎，后期产仔正常，但仔猪携带PPV病毒。细小病毒只感染猪，大小猪都易感，但仅初产猪表现症状。目前成世界流行趋势，给世界养猪业带来了巨大的经济损失。

PPV于1967年由Cartwright等在研究猪繁殖障碍性疾病时分离并首次发现其致病性[7]，在我国1983年首次分离到。研究者通过系统或局部等人工感染PPV的方式构建了许多动物模型，并对PPV致病性及其感染所致的组织病变等进行了研究。研究发现PPV可在多数动物组织和细胞（原代和传代细胞）中增殖，能引起较明显的组织和细胞病变，常作为模式病毒用于病毒感染机制和药物的抗病毒作用研究。

动物模型可以观察PPV对机体的侵害，造成的病理变化部位，也不需要复杂的仪器设备，操作简单，但实验动物个体差异大，且价格昂贵，还需准备畜舍，实验中受环境因素影响大，不可控因素多。相对于动物模型，构建细胞模型能有效地弥补动物模型的不足。由于细胞的生理特性的一致性，对病毒的易感性不存在差异，实验重复性好；而且细胞培养方便、经济、周期短，可以严格的执行无菌操作；另外，细胞培养能显示病毒的生长特征，采用空斑技术能对病毒进行克隆化。对病毒分子生物学特性研究，发病机制的研究、疫苗研制和抗病毒药物筛选都离不开体外细胞培养模型。

1 病毒体外培养的条件研究

PPV对宿主细胞有一定的选择性，一般在猪原代细胞上如猪肾、猪睾丸细胞及传代细胞（如 PK-15、ST和IBRS2等）和人的某些传代细胞（如 Hela，KB，Hep-2和Lul32等）上生长繁殖。Oraveerakul（1992）等比较了NADL-8、NADL-2、KBSH和 Kresse 4株PPV病毒株在不同细胞系中的复制情况，除了使用常用的来源于猪睾丸和猪肾的细胞系，研究中还使用了来自牛胎肺、牛皮肤、牛胎儿皮肤、牛肾、犬肾、绿猴肾、牛胎儿睾丸、狼皮肤、猪输卵管、绿猴肾、幼仓鼠肾、羊胎儿睾丸和人上皮癌细胞等细胞系，不同的病毒株在同一细胞上或者同一病毒株在不同细胞系上生长复制情况都不同。而且研究发现PPV病毒还能在牛、犬和狼的一些细胞系上生长复制。

PPV感染细胞一般有2种途径，一种是在细胞传代时同时加入病毒液，由于PPV的复制依赖细胞的蛋白质和核酸合成体系来完成其病毒粒子的复制，通常采用同步接毒方式繁殖PPV病毒。这种接毒方式可使易感细胞出现细胞病变（CPE）时间缩短，也可缩短细胞盲传周期。另一种是待细胞长到70%～80%时，弃掉培养基，加入病毒稀释液，待病毒与细胞作用一段时间后再加入细胞维持液，大多数病毒采用此种方式接毒。

病毒的体外培养受多种因素的影响，当细胞放置于体外培养时，培养环境如温度和气体环境、培养基以及血清类型和浓度都决定着细胞的生长状况，从而影响病毒的培养。魏战勇（2005）等将3种猪细小病毒毒株包括南京毒株1（NJ-1）、NJ-2和7909毒株接种于PK-15细胞，发现3个毒株的增殖规律基本相似，在感染后12 h后就可检测到荧光信号，随后逐渐增高，在感染48 h时几乎所有细胞都被感染，在感染60 h时其TCID50均达最高；在84 h时病毒引起细胞大面积崩解，由此可见这3中PPV病毒株在PK-15中收获较佳的时间是接种后60 h。该研究进一步测定发现培养液中PPV病毒粒子的半寿期为7 h[6]。唐满华（2013）等摸索了猪细小病毒M2株在ST细胞中培养条件并进行了优化。实验结果表明PPV M2株采用同步接种法相对于单层接种法更具优势。研究比较发现：在合适的细胞密度下，在培养基添加含不同血清及血清浓度采用可导致CPE出现的时间不同，而且毒力也不一样[4]。Wei（2009）等研究发现一氧化氮（Nitric oxide，NO）对猪细小病毒的体外增殖有一定的影响，用底物S-硝基-N-乙酰青霉胺（SNAP）和L-精氛酸（L-Arg）诱导产生的NO可使PPV感染细胞的作用受影响，其抑制效果与NO底物的浓度呈正相关，而且在一定浓度下SNAP抑制PPV的复制强于L-Arg；相关结果也表明NO的抗病毒作用主要发生在病毒感染的初始阶段[11]。

2 细胞模型在病毒诊断的应用

利用组织培养或细胞培养对病毒进行分离鉴定是一种常规的实验室诊断方法，通过病毒感染易感细胞、细胞病变并结合一些分子生物学检查手段能有效地分离和纯化病毒。猪细小病毒只感染猪，仅初产猪表现症状，根据猪繁殖障碍临床症状诊断时要与伪狂犬病、猪瘟、乙型脑炎和猪繁殖与呼吸综合征等病区分，需要分离病毒进行鉴别诊断。病毒分离有动物接种，鸡胚培养和组织或细胞培养法。动物接种如嗜神经性病毒（狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒和带状疱疹病毒等）可接种于小鼠脑内，痘病毒可接种于家兔角膜或皮内。鸡胚对多种病毒敏感，根据不同种类病毒，将病毒接种于鸡胚的不同部位。Zhang（2010）等在木乃伊和流产胎儿器官中分离到一株病毒，这株病毒能凝集豚鼠，兔和鸡的红细胞，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪细小病毒（PPV）。进一步将该病毒株通过接种于猪原代肾细胞和传代ST细胞能引起明显的细胞病变，并通过ELISA、免疫荧光分析、电镜观察以及测序结果确认是PPV BQ株[12]。

3 病毒与细胞宿主之间作用关系

非特异性免疫是抵御病毒感染的第一道防线，其通过信号通路诱导细胞产生细胞因子。细胞因子是由免疫细胞（如T细胞、B细胞和NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。病毒感染细胞过程中，引起细胞非特异性免疫反应，调控免疫应答。

3.1 干扰素

细胞因子中包括干扰素（IFN），干扰素有2类，分别是I型干扰素（病毒诱导型）和Ⅱ型干扰素（免疫调节型）。干扰素是一种广谱抗病毒剂，主要通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白。Wen Lin（2013）等使用荧光定量PCR和荧光素酶报告基因检测PPV感染ST细胞后是否诱导产生I型干扰素（IFN-α和IFN-β），以及是否阻断dsRNA诱导IFN-β启动子的活化。研究显示 PPV感染ST后不诱导产生I型干扰素且PPV的NS2蛋白阻断dsRNA诱导IFN-β启动子的活化[11]。这里的实验结果使我们对细小病毒的发病机制理解产生重大影响，也为我们今后研制一类新的抗病毒和抗炎药物提供参考。李厚伟（2011）等研究发现PPV感染PK-15细胞可引起的病毒DNA量的变化，在感染12 h后病毒开始大量迅速增殖，48 h达到最高峰，实验结果与魏站勇的结果相同[6]；同时使许多细胞因子（如IFN p、IFN 7、IFNAR-1、IFNAR-2、MHC-I、MHC-lI、MXl、iNOS、2-5AS、RNase L和IRF 3）的转录水平显著增加，其中Mxl基因在24 h转录量达到8 423倍[2]。

3.2 白细胞介素

PPV在感染胎儿死亡后可见多种组织和器官有广泛的细胞坏死、炎症和核内包涵体。白介素是参与细胞免疫反应的细胞因子。病毒接种于细胞后会引起细胞病变，为了解猪细小病毒（PPV）感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应，党玉丽等（2011）、刘石等（2011）和张彦桃等（2011）运用荧光定量PCR技术检测了猪细小病毒（PPV）感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化及白介素的分泌水平。结果表明白介素IL-6和IL-13的表达量在l、3和24 h明显增加，48 h时下降至低于对照水平；而IL-18的表达量在1 h无明显变化、在3～24 h增加，而48 h有下降趋势[1，3，5]。说明Marc-145细胞感染猪细小病毒后可引起IL-6、IL-13和IL-18的增加，细胞内白介素积极参与抵抗病毒的侵染。

4 抗病毒药物研究

寻找有效的抗病毒药物是目前很热门的研究方向，据报道甘草酸二铵能有效治疗几种病毒（如人的免疫缺陷病毒、甲型和乙型肝炎病毒、冠状病毒和疱疹病毒）。Li（2014）等用猪睾丸（ST）细胞为模型，研究了甘草酸二铵对PPV的作用，实验结果显示当甘草酸二胺提前处理要感染ST细胞的PPV病毒时对PPV病毒有强的抑制作用，且呈剂量依赖性。其实验结果还通过间接免疫荧光实验和荧光定量PCR实验进行了验证。脱氧胆酸盐是一种阴离子去除剂，此实验中被用作对照组，以排除甘草酸二胺充当洗涤剂抑制PPV感染的可能性。研究清楚地表明，甘草酸二胺在体外有直接抗PPV效果[9]。Li的研究为猪细小病的治疗开辟了新的研究方向。

5 总结和展望

体外模型是病毒研究中不可缺少的部分，无论是在病毒结构研究，致病机理，病情诊断，病毒分离纯化等都起着重要作用。迄今建立的PPV感染细胞模型主要方便了病毒的培养，克隆纯化。但是，细胞模型与病毒入侵机体还存在一定差距，毕竟机体的防御机制与单独的细胞防御存在差异。细胞模型还受环境，培养基的影响，最适培养条件有利病毒培养。抗病毒药物的研究空间很大，今后的研究中应研究更多的药物为防治PPV做出完善。

[1] 刘石，哈斯通拉嘎，王瑞宁，等.PPV感染Marc-145细胞后对其分泌IL-13转录时相的影响[J].浙江农业科学，2011，（3）：710-713.

[2] 李厚伟，魏战勇，尹海燕，等.猪细小病毒感染PK-15细胞抗病毒相关因子转录变化的分析[J].畜牧兽医学报，2011，42（1）：48-55.

[3] 张彦桃，梁秀丽，刘芳，等.猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响[J].河南农业科学，2011，40（6）：138-141.

[4] 唐满华，陈瑞爱，何玲，等.猪细小病毒M2株在ST细胞中培养条件优化[J].现代畜牧兽医，2013，（10）：56-60.

[5] 党玉丽，哈斯通拉嘎，耿静微，等.猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响[J].河南农业大学学报，2011，45（5）：568-570，584.

[6] 魏战勇，王学兵，陈红英，等.利用Real-time PCR技术检测猪细小病毒在PK-15细胞增殖动态研究[J].河南农业大学学报，2009，43（4）：398-401.

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[12] Zhang C F，Song C P，Chen C M，et al.Reproductive failure in wild boars associated to porcine parvovirus infection and in vivo and in vitro characterization of the causal isolate[J].Trop Anim Health Prod.2010，42（8）：1611-1613.

国家自然科学基金（31272630）和教育部博士点基金-新教师类（20114320120006）。

冯静（1988-），女，硕士研究生，主要研究方向动物生殖医学。

杨青（1976-），女。