混合菌株发酵麦秸生产蛋白饲料发酵条件的研究

2015-03-11孟顺利张力史兆国刘海霞韩大勇赵连娣王兴国陈婷婷

中国畜牧兽医文摘 2015年3期

关键词：木霉酵母秸秆

孟顺利张力史兆国刘海霞韩大勇赵连娣王兴国陈婷婷

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

混合菌株发酵麦秸生产蛋白饲料发酵条件的研究

孟顺利2张力1*史兆国2刘海霞1韩大勇1赵连娣2王兴国1陈婷婷1

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300；2.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070）

通过对绿色木霉、红芝、酵母三菌共同发酵条件的研究确定最佳的发酵条件。试验首先进行绿色木霉、红芝共同发酵，再接种酵母进行发酵生产蛋白饲料条件的研究。最终得出最优方案为即绿色木霉、红芝共同发酵8 d接种酵母，接种量5%，发酵时间48 h，发酵温度为28℃，培养基中真蛋白含量最高。

绿色木霉红芝酵母蛋白饲料

我国作为一个农业大国，每年产生大量的各种秸秆，而这部分秸秆只有不到10%用于饲料[1]，而其大部分被用于焚烧或者丢弃田间，这既造成了资源的浪费又对环境造成了污染，随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对环境污染问题也更加关注和重视，所以怎样提高秸秆的利用率成了亟待解决的问题。而限制秸秆利用率的关键问题是其含有大量的纤维素、半纤维素、木质素，这些成分很难被机体消化吸收，因此导致了利用率低的问题，所以要想解决这些问题，还要从降低秸秆的纤维素、半纤维素、木质素的含量，提高其营养价值的角度出发。大量的国内外学者也研究了不同的物理、化学的秸秆利用方法，但是都存在着秸秆利用不充分、成本高的问题[2-4]。而研究表明木霉、曲霉、白腐真菌类能够降解纤维素、半纤维素、木质素，且成本较低。何桂霞[5]研究发现绿色木霉和白腐真菌共同发酵秸秆其纤维素、半纤维素、木质素的降解率分别达到41.6%、36.35%和51.9%。黄茜[6]研究发现利用平菇和康氏木霉进行混合发酵在H6-T10的时候其降解秸秆效果最好，木质素降解率达到44.77%，纤维素降解率达到41.48%。

近年来，随着畜牧业的发展，饲料资源的不足日益严峻，因此很多学者都致力于纤维素酶和单细胞蛋白的研究，以更好地提高纤维素饲料的利用率[7-8]，单细胞蛋白营养丰富，蛋白质含量高，含有的氨基酸齐全且配比合理，除此之外还含有丰富的碳水化合物、脂类、维生素、矿物质[9]。尤其是酵母中还含有植物性胰岛素，多种酶和激素等活性物质，可以促进食欲和对养分的吸收利用提高生产率[10]，廖雪义等[11]利用木霉和酵母混合发酵秸秆生产蛋白饲料中，其发酵终产物中粗蛋白含量从4.2%提高到19.7%，粗纤维含量从36.2%下降到24.1%。王平[12]等利用米曲霉发酵玉米秸秆部分替代玉米饲喂鸡，发现鸡肠道中乳酸菌、米曲霉含量增加且大肠杆菌数量显著降低。所以本研究利用绿色木霉、白腐真菌、酵母的特性，对麦秸进行固体发酵，从绿色木霉、白腐真菌共同发酵时间、接种量、接种酵母后发酵时间、发酵温度四个方面，进行发酵条件的筛选和优化。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

绿色木霉X-57、红芝（由江苏农牧科技职业实验室保存），热带产朊假丝酵母（由广东微生物菌种中心提供，江苏农牧科技职业实验室保存）。

1.1.2 培养基

PDA培养基：称取去皮新鲜土豆200 g，切成小块，加水至1 L，煮沸30 min。用纱布过滤后加20 g葡萄糖、20 g琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1 L[12]。分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20 min。倾斜静置，待凝固后备用。

绿色木霉液体种子培养基：葡萄糖15 g，蛋白胨10 g，酵母膏10g，硫酸铵2.5 g，磷酸二氢钾6 g，氯化钙1 g，七水硫酸镁0.8 g，碳酸钙0.4 g，加水溶解定容至1 L，调节pH至4.8。分装入250 ml三角瓶中，装液量为50 ml/瓶。121℃灭菌30 min。

红芝液体种子液培养基：去皮马铃薯200 g，煮沸30 min，纱布过滤，加入20 g蔗糖，融化后补水至1000 ml，自然pH值，加入10 g秸秆粉，100 ml分装250 ml三角瓶，121℃间歇灭菌[13]。

YPD酵母菌种子液培养基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母膏1%，水95%，115℃灭菌30 min[14]。

固体发酵培养基：麦秸粉350 g，麸皮150 g，溶于1 L水，自然pH值，硫酸铵10 g，磷酸二氢钾2.5 g，碳酸钙2.5 g，七水硫酸镁1.25 g，氯化钴0.5 g，充分搅拌，分装到250 ml三角瓶中，每瓶装25 g，121℃灭菌60 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种的活化

将保存的菌种接种到PDA斜面培养基上，在28℃培养7 d，再转接，一般转接活化2～3次，于4℃保存备用[15]

1.2.2 种子液的制备

用接种环分别接种一环绿色木霉和红芝接种在绿色木霉和红芝液体种子培养基里面，在28℃分别培养3 d和5 d。

接种一环假丝酵母在YPD酵母菌种子液培养基里并在28℃培养20 h。

1.2.3 固体发酵

将发酵好的种子液按照绿色木霉和红芝的体积比为1：3的比例分别接种到固体发酵培养基上进行培养。

1.2.4 单因素接种酵母试验方法

1.2.4.1 酵母接种时间对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响

在绿色木霉和红芝发酵2 d、4 d、6 d、8 d、10 d时分别接种假丝酵母，酵母接种量（培养基：酵母的质量体积比）为3%，发酵温度为28℃，在发酵24 h时测定培养基的真蛋白含量。本试验共5个处理，每个处理3个重复。

1.2.4.2 酵母接种量对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响

在绿色木霉和红芝发酵6天时，分别接种1%、3%、5%、7%、9%的酵母，发酵温度为28℃，在发酵24 h时测定培养基的真蛋白含量。本试验共5个处理，每个处理3个重复。

1.2.4.3 酵母发酵时间对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响

在绿色木霉、红芝共同发酵6 d，酵母接种量为3%，发酵温度为28℃时，分别测定发酵12 h、24 h、36 h、48 h、60 h时固体发酵培养基中真蛋白的含量。本试验共5个处理，每个处理3个重复。

1.2.4.4 酵母发酵温度对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响

在绿色木霉、红芝共同发酵6天，酵母接种量为3%，发酵时间为24h时，分别测定发酵温度为22℃、25℃、28℃、31℃、34℃的情况下固体发酵培养基中真蛋白的含量。本试验共5个处理，每个处理3个重复。

1.2.5 多因素正交试验

试验结合单因素影响的试验结果，选取其中对发酵培养基中真蛋白含量影响较大的因素，接种时间为4 d、6 d、8 d，接种量为3%、5%、7%，发酵时间为24 h、36 h、48 h，发酵温度为25℃、28℃、31℃，进行多因素共同作用下的L9（34）优化组合正交试验，对不同因素水平组合条件下的真蛋白含量分别测定。本试验共9个处理，每个处理3个重复。

表1 接种酵母发酵正交试验设计

1.2.6 真蛋白含量的测定

将培养好的固体培养基进行80℃烘干，测定其真蛋白含量，测定方法见张丽英主编[15]《饲料分析及饲料质量检测技术》

1.2.7 数据处理

采用软件SPSS 19.0对单因素试验的数据进行方差分析，对正交试验的数据进行极差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素接种酵母试验结果

2.1.1 酵母接种时间对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响结果

表2 不同接种时间对培养基中真蛋白含量的影响

注：同列标不同字母的表示差异显著（P＜0.05），同列标相同字母的标志之间差异不显著（P＞0.05）。

由表2可知随着绿色木霉、红芝发酵时间的延长，在相同条件下培养基中真蛋白的含量呈现先增加再降低的趋势，真蛋白含量最高是在发酵第8 d，达到8.855%，而且第8 d时与其他各组差异显著（P＜0.05），最少是在第2 d，只有5.865%。

2.1.2 酵母接种量对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响结果

表3 不同接种量对真蛋白含量的影响

由表3可知在其他条件相同的情况下，随着酵母接种量的增加，培养基中真蛋白的含量呈现逐渐增加的趋势，但是在接种量为5%及以后其真蛋白含量差异不再显著（P＞0.05），最高是在接种9%，达到9.28%，在节约资源和成本的原则下选择接种量为3%、5%、7%为最优结果，再进行优化试验。

2.1.3 酵母发酵时间对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响结果

表4 不同发酵时间对真蛋白含量的影响

由表4可知，在接种酵母后，随着发酵时间的延长，培养基中真蛋白的含量逐渐增加，在发酵60 h后达到最高值为10.41%，发酵36、48、60 h的时候其增加量逐渐降低，且在其之间真蛋白含量差异不显著（P＞0.05），发酵12、24 h与其他各组之间差异都显著（P＜0.05）。以节约时间成本考虑，选择发酵24、36、48 h为最优组别再进行优化。

2.1.4 酵母发酵时间对固体发酵培养基中真蛋白含量的影响结果

表5 不同发酵温度对真蛋白含量的影响

注：同列标不同字母的表示差异显著（P＜0.05），同列标相同字母的标志之间差异不显著（P＞0.05）。

从表5中可以看出，随着发酵温度的增加，培养基中真蛋白含量先是逐渐增加，在28℃之后又逐渐降低，28℃时达到最高值为9.115%，与其他各组差异显著（P＜0.05），也可以推断出其最适温度范围为25℃～31℃，所以选择25℃、28℃、31℃为最优，再进行优化选择。

表6 接种酵母正交试验结果

2.2 多因素正交试验结果

从表6中比较各个因素水平均值，求出每个因素的最大平均值，可以得出培养基的最优方案。其最优方案为A2B2C3D2，即接种时间为8 d，接种量5%，发酵时间48 h，发酵温度为28℃。通过分析，列出各个因素对指标影响的大小进行排序。从表6中可以看出，对真蛋白含量影响最大的是发酵时间，依次是发酵温度、接种量、接种时间。

3 结论

本试验通过对绿色木霉、红芝、酵母共同发酵培养条件的研究，进行了单因素试验和多因素的正交试验，综合了规模化培养及实际生产过程中的成本考虑，最终得出最优方案为绿色木霉、红芝共同发酵8 d接种，接种量5%，发酵时间48 h，发酵温度为28℃，培养基中真蛋白含量最高。由于试验所用菌种是从外购买，其各种产酶活性及各种生理生化指标试验都需要进一步进行，这些工作有待于今后逐步研究。

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