诱导神经干细胞的研究进展及应用前景

综述与专论

诱导神经干细胞的研究进展及应用前景

唐玺和，陈志国，张愚

(首都医科大学宣武医院细胞治疗中心，北京100053)

【摘要】诱导神经干细胞(induced neural stem cells,iNSCs)是通过在成体细胞内转入特定外源因子而获得。目前主要有两种途径获得iNSCs,即直接诱导法和间接诱导法(需经历重编程过程中不稳定的中间状态)。与诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)比较，iNSCs直接将成体细胞重编程为神经干细胞，而不经过iPSCs再分化为神经干细胞，可减少其致瘤性，缩短诱导周期,提高转分化效率，这将使其更适于临床应用。本文就iNSCs的研究进展，应用前景加以综述。

【关键词】诱导神经干细胞；体细胞重编程；诱导多能干细胞；治疗

[基金项目]973计划重点项目(2012CBA01307)帕金森氏病干细胞治疗的研究。

[作者简介]唐玺和(1981-)男，博士研究生，研究方向：诱导神经干细胞治疗帕金森氏病。

[通讯作者]陈志国(1977-)，研究员，博士生导师，研究方向：神经退行性疾病的干细胞治疗。Email：chenzhiguo2999@yahoo.cn；张愚(1967-)，研究员，博士生导师，研究方向：帕金森氏病的神经干细胞治疗。Email:yaz@bjsap.org。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.016

Advances and application of induced neural stem cells

TANG Xi-he, CHEN Zhi-guo, ZHANG Yu

(Cell Therapy Center, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China)

Abstract【】It has been reported that induced neural stem cells(iNSCs) can be obtained from rodent and human somatic cells through the forced expression of defined factors. Two different approaches have been successfully used to obtain iNSCs:a direct method and an indirect method which involves an unstable intermediate state.Compared with induced pluripotent stem cells (iPSCs) and embryonic stem cells(ESCs)，iNSCs are committed towards neural lineage, enabling them with a lower risk of tumorigenicity and more efficient transdifferentiation which makes it suitable for clinical use in the future.

【Key words】Induced neural stem cells; Somatic cell reprogramming;Induced pluripotent stem cells; Therapy

干细胞为许多神经系统疾病治疗带来希望，比如帕金森氏病[1]，肌萎缩性脊髓侧索硬化症[2]，老年性痴呆[3]及脊髓外伤性[4-6]疾病。长期以来，科研人员试图使用外科技术或者立体定向技术将ESCs(胚胎干细胞)或者由其分化到某一阶段的神经细胞移植到病变部位，使其定植并产生功能，达到治疗作用。大量研究表明，使用胚胎干细胞治疗帕金森病、脊髓损伤及糖尿病有一定作用，但胚胎干细胞的致瘤性，异体移植的免疫排斥以及伦理学争议限制其应用。2006年，Yamanaka利用小鼠成纤维细胞成功获得iPSCs，开创了干细胞研究的新局面[7]，该研究使自体干细胞移植成为可能。2007年，Yamanaka[8]及Wernig[9]报道了由人成纤维细胞获得iPSCs，之后iPSCs治疗相关疾病的细胞模型及动物模型也成功建立，为iPSCs向临床应用做了大量前期工作。但是，研究发现，iPSCs用于临床治疗还面临很多问题，如致瘤性，定向分化效率低，安全性问题。因此，将体细胞直接诱导为成体干细胞，而不经过iPSCs阶段，以减少其致瘤性，提高分化效率成为研究热点。

1体外获得iNSCs的方法

目前诱导神经干细胞方法主要分为直接诱导法和间接诱导法。直接诱导即在成体细胞内转入神经干细胞表达的特定外源基因，microRNAs或者小分子蛋白等，直接获得iNSCs。间接诱导：在成体细胞重编程为iPSCs过程中(可以称之为中间状态或者不稳定状态)，改变诱导环境，使其成为iNSCs。

1.1成体细胞直接重编程为神经干细胞或者神经前体细胞

该方法主要是在成体细胞中直接转入神经干细胞表达的某些相关基因，使其直接重编程为神经干细胞。Lujan[10]等报道转入11个神经干细胞相关的外源基因可以将小鼠成纤维细胞诱导成神经干细胞，该细胞在体外可以分化出星形胶质细胞，少突胶质细胞及成熟神经元，并能在体内存活。Sheng C等[11]转入Ascl1、Ngn2、Hes5等9个神经干细胞相关基因将小鼠睾丸支持细胞诱导成神经干细胞，该细胞在体外能分化出多巴胺能神经元，胆碱能神经元及神经胶质细胞。Han等[12]报转入Brn4、sox2、klf4、c-Myc、E47基因或转入Brn4、sox2、klf4、c-Myc均将小鼠成纤维细胞诱导为神经干细胞，诱导神经干细胞能在体外在传代130次以上，且与野生型神经干细胞形态，基因表达，十分相似。研究还发现转入4因子与5因子诱导的神经干细胞与野生型神经干比较，同样有成熟的分化能力，可分化出星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞。Ring等[13]用逆转录病毒载体携带sox2转染小鼠成纤维细胞，6～10 d后就出现神经干细胞克隆。而转染人成纤维细胞后，5 d内就出现了神经干细胞克隆，将诱导神经干细胞与野生型神经干细胞同时移植免疫缺陷小鼠，没有肿瘤形成，证明诱导神经干细胞的安全性。Saiyong Zhu[14]等只使用OCT4单个基因联合A83-01、CHIR99021、NaB、LPA、rolipram、SP600125成功的将人成纤维细胞诱导为神经干细胞，经过4周体外自然分化，能分化出成熟的神经元。移植小鼠脑内后，该细胞能向神经元分化，且无肿瘤形成。Kim SM 等利用逆转录病毒携带Klf4、c-Myc、Sox2、Brn4转染小鼠成纤维细胞，4周后获得诱导神经干细胞，神经干细胞无成瘤性[15]。

1.2成体细胞经过iPSCs中间状态诱导为神经干细胞，即在成体细胞中转入经典Yamanaka 四因子(或者略加减)后，在iPSCs诱导的早期改变培养基，使其能向神经干细胞方向发展

Kim等[16]使用Dox载体系统在小鼠成纤维细胞中转入oct4、sox2、klf4、c-myc基因，在含有LIF的MEF上培养3～6 d后继续在神经干细胞培养基中培养8～9 d，将会有表达plzf、pax6等神经干细胞标志的克隆出现，这种“类似神经干”细胞，可以继续分化出星形胶质细胞、神经元，但是此种干细胞在体外只能扩增3～5代。裴端卿等[17]使用非整合载体oriP/EBNA episomal携带oct4、sox2、sv40lt、klf4和microRNA302-367 电转人尿液中提取的活细胞，然后在神经干细胞培养基中加入CHIR99021、PD0325901、A83-01、Thiazoviv、DMH1，电转后12 d可见神经干细胞克隆出现，且能表sox1、sox2、pax6等神经干细胞标志性基因，诱导的神经干细胞能分化成星形胶质细胞，多巴胺能神经元，谷氨酸能神经元，但是不能自然分化为少突胶质细胞，在使用PDGF-AA、NT3等小分子刺激后，可以分化出少突胶质细胞。同时，将诱导神经干细胞移植入新生小鼠纹状体后，神经干细胞能够存活，迁移，脑内没有形成肿瘤，证明诱导神经干细胞的体外分化能力及安全性。张素春等[18]等使用仙台病毒为载体，将oct4、sox2、klf4、c-Myc转入人成纤维细胞，在神经干细胞培养基中加入LIF、CHIR99021、SB431542三个小分子，之后通过升高培养温度(39℃)使得仙台病毒灭火，第13天可见神经干细胞克隆形成。其表达nestin、sox1、sox2、fabp7、pax6、hes5、notch1等神经干细胞的标志性基因，并且在体外可以分化为星形细胞，神经元及少突胶质细胞，该类细胞还具有脑区特异性。目前经iPSCs中间状态诱导神经干细胞的方法受到推崇，因为其诱导体系随着诱导iPSCs体系变革而更加安全。此前诱导iPSCs方法的缺点主要是向供体细胞中引入外源基因，且病毒转染时可能将外源基因整合到细胞基因组中，导致供体细胞基因突变，另外，c-Myc，Klf4是致癌基因，可以增加细胞的成瘤性，因此，提高iPSCs的安全性主要在转入因子选择及载体的进一步改进。Nakagawa M等[19]在无c-Myc下将体细胞重编程为iPSCs，降低了iPSCs的成瘤性。Anokye-Danso等[20]采用miRNAs在无转录因子作用下直接诱导iPSCs。邓宏魁等[21]单纯使用化学小分子成功诱导出iPSCs，提供了更加安全的诱导系统。另外，除了成纤维细胞做为供体细胞外，Loh Y.HStaerk,JDowey SN等[22-24]使用外周血中的T细胞或单个核细胞成功诱导出iPSCs，免去了获取成纤维细胞的侵袭性操作，这也提示了使用外周血单核细胞诱导神经干细胞的可能性。

2诱导神经干细胞的优点及应用前景

2.1安全性与多能性的统一

神经干细胞移植被认为是治疗很多神经变性疾病及神经退行性疾病的新方法，除了病变神经细胞的功能替代，干细胞释放的神经保护因子及生长因子对疾病治疗也有作用。目前开展的动物实验模型有帕金森病[1, 25]，亨廷顿舞蹈症[26]，多发性硬化[27]，脑卒中[28]及脊髓损伤[29]等，实验结果显示干细胞治疗效果明显，但是其用于临床治疗的效果并不明显,这可能与移植细胞的数量，移植方法等有关系[30-33]。ESCs细胞与iPSCs具有多向分化能力，移植后成瘤性强[34]，而诱导神经干细胞具有分化的特异性，主要向星形胶质细胞，少突胶质细胞，神经元方向分化，其致瘤性下降[35]。与成体细胞相比，神经干细胞在移植后仍然能维持自我更新及多向分化能力，对于脑神经损伤及脊髓损伤这种并非只是单一神经细胞病变的疾病，使用诱导神经干细胞治疗更加合适[36, 37]。

2.2诱导自体神经干细胞减少移植免疫排斥

同ESCs细胞及其他供体来源干细胞移植相比，iPSCs与诱导神经干细胞可来自本体，能减少免疫排斥反应。但是经过细胞重编程，外源基因插入以及某些自体基因被修饰，使得自体iPSCs移植仍然存在免疫反应[38]，iNSCs是否因为某些基因表达不同而较iPSCs引起移植后免疫反应减弱，需要进一步探讨。由供体细胞获得诱导神经干细胞需要一定周期，这对一些慢性疾病影响较小，但对于存在治疗时间窗的急性疾病，如脑卒中，将影响其临床应用。

2.3诱导周期缩短及分化效率提高

与iPSCs相比较，诱导神经干细胞周期明显缩短[10，12，13]，尽管诱导神经干细胞效率不高，但其能在体外快速扩增，数量能够满足临床需求，而且更易分化为神经细胞。而由iPSCs分化神经干细胞，需要经历不同的分化阶段，耗时，且所得细胞并非处同一分化阶段，单一细胞纯度不高[34]，这是iPSCs临床应用前要解决的问题。

目前，诱导神经干细胞研究主要集中在如何缩短体细胞转分化的周期及提高转分化效率，以及外源因子载体的安全性，移植治疗的有效性。另外，病变部位细胞原位转分化为神经干细胞以起到治疗作用也是很有意义的研究方向。

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〔修回日期〕2014-11-05