姜黄素抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤的生长

研究报告

姜黄素抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤的生长

刘冬菊1,姚宇1，黄文革2

(1． 广州中医药大学第三附属医院, 广州510360; 2. 中山大学实验动物中心，广州510080)

【摘要】目的探讨姜黄素对人宫颈癌CaSki细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型，35只荷瘤裸鼠随机分为5组，姜黄素高剂量(200 mg/kg)、中剂量(100 mg/kg)、低剂量(50 mg/kg)组、溶剂对照组和顺铂组(3 mg /kg)，每组7只，姜黄素连续灌胃给药15 d，顺铂组每3 d腹腔注射给药，共5次。停药24 h后处死裸鼠，测量裸鼠体重、移植瘤体积、瘤重，计算抑瘤率；光镜下观察移植瘤组织形态学变化；结果处理组的移植瘤体积均明显小于空白对照组(P

【关键词】宫颈癌；姜黄素；移植瘤

[基金项目]广东省科技计划

[通讯作者]刘冬菊(1971-)，女，副主任医师，硕士生导师，主要从事妇科肿瘤的研究。Email: weila_dongju@163.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.002

Inhibitory effect of curcumin on the growth of human cervical

carcinoma (CaSki) xenografts in nude mice

LIU Dong-ju1，YAO Yu1，HUANG Wen-ge2

(1. the Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510360, China；

2. Laboratory Animal Center of Zhongshan University, Guangzhou 510080)

Abstract【】ObjectiveTo study the inhibitory effect of curcumin on the growth of human cervical carcinoma CaSki xenografts in nude mice. MethodsHuman cervical cancer cell line CaSki cells were inoculated subcutaneously into nude mice. Thirty-five tumor-bearing mice were randomly divided into 5 groups: curcumin high dose (200 mg/kg), moderate dose (100 mg/kg), low dose (50 mg/kg), solvent control group and cisplatin group (3 mg/kg), 7 mice in each group. Curcumin was orally administered once per day for consecutive 15 days. Intraperitoneal injection of cisplatin was given every three days, for a total of five times. The mice were sacrificed 24 h after the end of treatment and the body weight, tumor volume, tumor weight were measured and the inhibition rate was calculated. The histological changes of tumor tissue was examined. Results The tumor volumes of the treated group were significantly lower than that of the control group (P<0.01). The tumor inhibition rate of the curcumin high, medium and low dose groups were 44.3%, 40.1% and 33.3%, respectively. Apparent necrosis was observed in the tumors of the curcumin-treated groups. ConclusionCurcumin possesses apparent inhibitory effect on the growth of transplanted tumors of human cervical cancer CaSki cells in nude mice.

【Key words】Cervical cancer; Curcumin; Xenografts; Nude mice

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率居女性恶性肿瘤第二位。我国每年子宫颈癌新病例数为13.15万，约占全球总数的1/3，每年有2万～3万妇女死于子宫颈癌。以顺铂为基础的化放疗晚期及转移宫颈癌主要的治疗方式。顺铂严重的消化道反应、肾毒性、神经毒性及骨髓移植的不良反应使其在临床应用受到限制。因此迫切需要寻找并研究高效无毒副作用的新药。大量研究发现中药姜黄素(curcumin)具有多种生物学活性，是一种具有良好发展前景的药物。它具有抗癌广谱、不良反应小的优点，已成为目前研究热点。本文主要探讨姜黄素对人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤生长的作用。

1材料和方法

1.1细胞.、药品及主要试剂

人宫颈癌CaSki细胞购于广州龙龙生物科技有限公司。姜黄素(Sigma公司)；注射用盐酸顺铂 (齐鲁制药有限公司)；BD Matrigel：购于广州龙龙生物科技有限公司。1640培养基及胎牛血清购自Gibco公司；

实验动物：SPF级BALB/c nu/nu 雌性裸小鼠35只，4～5 周龄，体质量 (15～20) g，购于中山大学(大学城)实验动物中心，生产合格证编号：SCXK(粤)2011-0029。动物级别SPF级，N0：44008500006263。所有裸鼠均由中山大学(北校区)实验动物中心饲养，医学实验动物使用许可证编号： SYXK(粤)2012-0081。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养：人宫颈癌CaSki细胞常规进行细胞复苏、传代，调整细胞浓度，取对数生长期的细胞进行试验。

1.2.2裸鼠的饲养：裸鼠饲养于中山大学实验动物中心SPF 屏障系统的洁净层流架内，温度(25±1)℃，相对湿度40%～60%。实验用裸鼠所用的垫料、食物、水等均经过灭菌处理。

1.2.3人宫颈癌CaSki细胞裸鼠皮下移植瘤的建立：Caski细胞以2×106个细胞铺至10 cm2的培养皿中，培养48 h后用0.25%胰酶消化消化细胞，计数，离心，用无血清的培养基稀释到所需浓度，并计算好所需细胞，取出并离心；取出溶解的Matrigel(浓度为100%)，用无血清的培养基稀释至50%；按照细胞悬液：50% Matrigel=1∶1混匀。Matrigel终浓度为25%，细胞密度为2×106个/200 μL；酒精消毒后,用1.0 mL注射器将0.2 mL细胞悬液(约2.0×106细胞)注入裸鼠右侧腋窝处皮下。待移植瘤大小约100 mm3，按数字随机法分为5组，每组7只，进行给药。①溶剂对照组：0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL；② Curcumin低剂量组：50 mg/kg；③ Curcumin中剂量组：100 mg/kg；④ Curcumin高剂量组：200 mg/kg；⑤顺铂组，顺铂3 mg/kg。顺铂组腹腔注射，每3 d 1次，其余各组每天灌胃1次，共15 d。

1.2.4肿瘤体测量及抑瘤率的计算：定期观察小鼠的饮食、精神、排便情况，于给药前一日及给药后每3 d用游标卡尺测量移植瘤的长径(a)、短径(b)；给药前用电子天平测量裸鼠体质量。停药后24 h，将裸鼠颈椎脱臼法处死，剥取瘤组织，可见部分裸鼠肿瘤旁有淋巴结转移，称重瘤组织，常规剖腹观察未见腹水及其它脏器转移，称瘤体重量，计算抑瘤率。抑瘤率(IR%)=[(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重] × 100%。按以下公式计算肿瘤体积。肿瘤体积(V)=ab2/2。

1.2.5移植瘤组织病理学观察：取瘤后，10%中性甲醛液固定，标本经脱水、包埋、切片，HE染色。用Leica DM5000B普通光学显微镜观察各组课鼠移植瘤组织及心、肝、肺、肾等组织标本的结构变化。

1.2.6统计学方法：用SPSS 19.0统计软件包进行数据处理，瘤体生长曲线采用重复测量方差分析，不同组间比较采用One-way ANOVA分析。

2结果

2.1裸鼠成瘤情况及各治疗组对裸鼠移植瘤生长的抑制作用

裸鼠接种CaSki后，5～7 d可见直径约2～3 mm的瘤样结节，质地软。继续观察接种第15 天，瘤样结节质地渐硬，本实验35只裸鼠成瘤率为100%。按裸鼠肿瘤体积大小随机分5组，每组7只, 治疗前各组裸鼠平均体重无明显统计学差异 (P>0.05)。

2.2荷瘤裸鼠治疗前后体质量的变化

用药期间，顺铂组小鼠逐渐出现活动减少，厌食，皮肤干涩，消瘦等表现。其余各组一般状况良好，未见药物不良反应。经过15 d治疗，各组裸鼠的平均体重如表1：示，顺铂组与对照组相比，裸鼠体质量明显下降(P<0.01)，姜黄素各治疗组裸鼠体重与对照组及之前相比，并无明显变化(P>0.05)。

表1　各组裸鼠体重、肿瘤体积、瘤重的变化 ± s)

与对照组比较aP<0.05，与姜黄素低剂量组比较bP<0.05

Note. Compared with the control group,aP<0.05. Compared with the curcumin low dose group,bP<0.05.

2.3各处理组裸鼠肿瘤体积变化

接种瘤细胞后各组肿瘤体积均逐渐增大，对照组肿瘤体积增长较快，各治疗组移植瘤体积均小于对照组，且差异均具有统计学意义(P<0.05)。随着姜黄素治疗剂量的增高，移植瘤体积减缓。姜黄素低剂量组肿瘤体积与顺铂组比较差异有统计学意义(P<0.05)。姜黄素中、高剂量组与顺铂比较无统计学意义。(表1，图1)。

2.4各处理组裸鼠肿瘤生长抑制率和瘤重的比较

顺铂组肿瘤生长抑制率为54.3%，姜黄素低、中、高剂量组抑制裸鼠CaSki皮下移植瘤的抑制率分别为33.3%、40.1%、44.3%，见表1。在治疗终点，各治疗组移植瘤质量比对照组均有降低，顺铂组与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，而姜黄素组与对照组比较则差异无统计学意义(P>0.05)。姜黄素各处理组瘤重与对照组比较差异无统计学意义，顺铂组瘤重与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)。

图1　裸鼠宫颈癌的生长曲线( ±s， n=7) Fig.1　The growth curves of transplanted cervical tumor in the nude mice( ±s, n=7)

2.5裸鼠移植瘤组织的病理学观察

各组肿瘤细胞呈漩涡状、簇团状生长，被增生的纤维组织间隔，肿瘤细胞呈圆形或卵圆形，核大，核仁清晰，部分肿瘤细胞胞浆可见空泡，瘤团间可见坏死灶形成。随姜黄素治疗剂量的增高，瘤组织的坏死区域逐渐增大(图2，见文后彩插1)。

3讨论

姜黄素(curcumin)是从姜科植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素，具有抗炎、抗氧化、抗动脉硬化、预防血栓和抗肿瘤的多种生物学效应[1-3]。美国国立癌症研究所已经用姜黄素进行I期临床试验[4]。体外实验证实姜黄素对胃癌[5]肺癌[6]乳腺癌[7]等多种肿瘤细胞具有抑制生长和诱导凋亡的作用。目前认为姜黄素能影响肿瘤发生发展的多个环节与步骤，抗肿瘤机制也是多方面的。

姜黄素可通过调控Bcl-2基因家族及激活p53蛋白等方式，抑制肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡；姜黄素还可通过抑制NF-KB活化、抑制STATs通路、抑制MAPK通路等不同的方式诱导肿瘤细胞周期阻滞；徐唠等[8]研究表明姜黄素能抑制人宫颈癌CaSki细胞生长, 降低CaSki细胞侵袭和迁移能力,其机制与降低MMP-2，MTl-MMP and NF-KB的表达有关。

以上均为姜黄素体外实验研究，而姜黄素体内实验国内外研究报道较少。通过对人类非小细胞肺癌动物研究，发现姜黄素降低了原位人类非小细胞肺癌裸鼠肿瘤的生长，增加了无胸腺小鼠的生存期，实验发现其机制与姜黄素抑制COX-2，p65的表达，降低ERK1/2的活性有关[9]。

我们通过建立人宫颈癌Caski细胞裸小鼠移植瘤模型，研究不同剂量的姜黄素治疗肿瘤效果，实验中采用了0.5%羧甲基纤维素钠作为阴性对照，以细胞毒药物顺铂为阳性对照，对不同浓度姜黄素治疗疗效进行观察评估。

通过对各处理组生长曲线和与阴性对照组比较，以及处理后平均瘤重比较，结果显示姜黄素对宫颈癌荷瘤裸鼠移植瘤生长有抑制作用。高、中、低浓度组的姜黄素的肿瘤抑制率分别为44.3%、40.1%和33.3%，用药的效果呈剂量依赖性，随姜黄素剂量的增加，抑瘤效果增强(表1)。用药期间荷瘤鼠没有进食减少、行动迟缓、消瘦，体表温度下降等副反应，说明姜黄素安全性高、无毒副作用。并且HE染色病理检查发现(图2)，随姜黄素治疗剂量的加大，瘤团间可见坏死灶的比例增大,与对照组比较具有统计学意义；这说明姜黄素通过破坏移植瘤周围的血管上皮组织，导致血栓的形成，阻断移植瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退或消失。Yoysungnoen-Chintana P等[10]研究发现高剂量姜黄素具有抑制宫颈癌CaSki细胞裸鼠肿瘤的生长和血管生成的作用，其机制是通过下调CaSki细胞裸鼠移植瘤血管内皮生长因子、COX-2和EGFR的表达，并认为姜黄素对宫颈癌具有治疗作用。

本研究结果显示，姜黄素对宫颈癌裸鼠移植瘤的的生长具有抑制作用。为姜黄素成为新型抗肿瘤药及临床治疗宫颈癌提供了理论依据，姜黄素抑制肿瘤生长、转移的机制有待进一步研究。

参考文献：

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[2]Shao ZM, Shen ZZ, Liu CH, et al. Curcumin exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells [J]．Int J Cancer, 2002, 98(2): 234-240.

[3]Zhao J, Zhao Y, Zheng W, et al．Neuroprotective effect of curcumin on transient focal cerebral ischemia in rats [J]．Brain Res, 2008, 1229(7): 224-232．

[4]Odot J, Albert P, Carlier A, et al. In vitro and in vivo anti-tumoral effect of curcumin against melanoma cells [J]. Int J Cancer, 2004, 111(3): 381-387.

[5]樊华, 俞军。 姜黄素对人胃腺癌细胞株BGc-823生长抑制及诱导凋亡的作用 [J]．临床肿瘤学杂志, 2012, 17(5): 408-411．

[6]何秋霞, 侯海荣, 袁延强, 等．姜黄素对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响 [J]．中华中医药学刊, 2010, 28(10): 2130-2132．

[7]Choudhuri T, Pal S, Agwarwal ML, et al. Curcumin induces apoptosis in human breast cancer cells through p53-dependent Bax induction [J]. FEBS Lett, 2002, 512: 334-340.

[8]徐唠, 牟晓玲, 赵敬. 姜黄素对人宫颈癌细胞Caski侵袭转移的影响 [J]. 中山大学学报(医学科学版). 2009, 30(1):9 2-95

[9]Lev-Ari S, Starr A, Katzburg S. Curcumin induces apoptosis and inhibits growth of orthotopic human non-small cell lung cancer xenografts [J]. J Nutr Biochem. 2014, 25(8): 843-850.

[10]Yoysungnoen-Chintana P, Bhattarakosol P, Patumraj S. Antitumor and antiangiogenic activities of curcumin in cervical cancer xenografts in nude mice [J]. Biomed Res Int. doi: 10.1155/2014/817972. Epub 2014 Apr 16.

〔修回日期〕2014-11-04