单侧肾切除及微渗透泵灌注血管紧张素Ⅱ诱导小鼠肾纤维化与高血压模型的建立

研究报告

单侧肾切除及微渗透泵灌注血管紧张素II诱导小鼠肾纤维化与高血压模型的建立

陈建，曾莉， 陈刚，何立群

(上海中医药大学附属曙光医院，上海200021)

【摘要】目的建立单侧肾切除及微渗透泵灌注血管紧张素II诱导小鼠肾纤维化模型。方法将36只雄性野生型 c57BL/6小鼠随机分为3组正常组、模型组、生理盐水对照组，每组12只。正常组不做处理，模型组行单侧肾切除及微渗透泵灌注血管紧张素II，生理盐水对照组行单侧肾切除及微渗泵灌注生理盐水。观察造模前及造模后第2周、第4周小鼠血压，及造模4周后的24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、肾脏病理。结果实验第二周时，生理盐水对照组(P<0.05)及模型组(P<0.01)的血压较正常组升高，模型组较生理盐水对照组也升高(P<0.05)；实验第四周时，模型组血压较正常组(P<0.01)及生理盐水对照组(P<0.05)均升高。模型组的血肌酐、血尿素氮数值较正常组均上升(P<0.05)；模型组24 h尿蛋白定量数值较正常组与生理盐水对照组的升高(P<0.01)，模型组HE染色结果近曲小管上皮细胞浑浊肿胀；模型组Masson染色结果胶原纤维阳性率显著高于正常组和生理盐水对照组(P<0.05)。结论 单侧肾切除+微渗透泵灌注血管紧张素II可以成功建立小鼠肾纤维化模型及高血压模型。

【关键词】血管紧张素II；高血压；肾纤维化；高血压肾损害；

[基金项目]国家自然科学基金(81173219)；上海市科学技术委员会科研计划项目(编号:11ZR1437700)；国家临床重点专科，国家中医药管理局重点学科；上海市中医药事业发展三年行动计划项目(ZYSNXD-CC-YJXYY)。

[作者简介]陈建(1987-)，男，研究方向：中西医结合治疗慢性肾脏病的临床与基础研究。E-mail: 13120557664@163.com。

[通讯作者]陈刚(1973-)，男，研究方向：中西医结合诊治肾病的临床和实验研究。Email: 53821650@163.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.007

Establishment of a mouse model of renal fibrosis and

hypertension induced by unilateral nephrectomy and

infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump

CHEN Jian, ZENG Li, CHEN Gang, HE Li-qun

( Shuguang Hospital，Shanghai University of TCM，Shanghai 200021, China)

Abstract【】ObjectiveTo establish a mouse model of renal fibrosis and hypertension induced by unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump. Methods Thirty-six 8-week old wild type male c57BL/6 mice were randomly divided equally into three groups. The normal group was not treated, model group underwent unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump, and the saline control group underwent unilateral nephrectomy and infusion of physiological saline using a micro-osmotic pump. Blood pressure was measured before and two and four weeks after modeling. The 24 h urine protein quantity, serum creatinine (Scr), and blood urea nitrogen (BUN) were measured, and renal pathology was examined at 4 weeks after modeling. ResultsAt 2 weeks of the experiment, the blood pressure in the saline control group and model group was significantly higher compared with that of the normal group (P<0.05, P<0.01), and the blood pressure of the model group was significantly higher than that of the saline control group (P<0.05). Four weeks after operation, the blood pressure in the model group was still higher than that of the normal group (P<0.01) and the saline control group (P<0.05). Both the levels of Scr and BUN in the saline control group and model group were significantly higher than those of the control group (P<0.05, P<0.05). The 24 h urine protein quantity in the model group was markedly higher compared with that of the saline control group and normal group (P<0.01). The pathological examination showed that proximal tubular epithelial cells were swollen in the model group. Histology using Masson staining showed that the positive rate of collagen fibers in the model group was significantly higher than that of the normal group and saline control group (P<0.05).ConclusionsOur results demonstrate that a mouse model of renal fibrosis and hypertension can be successfully established by unilateral nephrectomy and infusion of angiotensin II using a micro-osmotic pump.

【Key words】Angiotensin II; Hypertension; Renal fibrosis; Hypertension; Renal damage; Mouse

肾脏是高血压病最重要、最常见的靶器官之一。长期的高血压可导致高血压性肾损害，特别是恶性高血压，如不干预最终将发展至肾功能衰竭。据文献报道，国内外由高血压造成的肾脏损害进入慢性肾功能不全的患者人数，呈逐年上升趋势[1，2]。肾纤维化是高血压产生肾脏损害的表现形式，也是慢性肾脏病发展为终末期肾衰竭的共同通路。目前常用的肾纤维化模型虽然纤维化程度等都符合实验需求，但其与人类高血压导致的肾纤维化发生机理相差很大，实验中常用的高血压模型也不一定能导致肾损害，所以目前仍没有一种合适的因高血压病导致肾纤维化的理想模型，我们尝试建立更接近人类高血压肾损害发病机理的动物模型——微渗泵灌注血管紧张素II诱导肾纤维化小鼠动物模型。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物：选用鼠龄8周的雄性野生型 c57BL/6小鼠36只，体重(25±3)g, 由上海斯莱克实验有限公司提供，SCXK( 沪)2012-0002。实验小鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心SYXK( 沪)2009-0069，温度25℃、12 h 光照、45% 湿度的环境中，自由饮水，进食标准普通饲料，封闭管理。

1.1.2实验材料及药物： 人血管紧张素 II (AngII)醋酸盐：Sigma公司生产；ALZET微渗透泵：Sigma公司生产。

1.1.3主要试剂： 尿蛋白定量试剂盒、尿素氮试剂盒、肌酐试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)。

1. 1.4主要仪器： 小鼠血压测定使用美国 Visitech Systems BP-2000 小鼠无创血压仪。M5 型酶标仪(美国MD公司)，GL-20G-II型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)。Microm HM 325 轮转切片机( 美国MD公司)，Leica DMIL 倒置相差显微镜(美国莱卡公司)。

1.2实验方法

1.2.1分组：将36只雄性野生型 c57BL/6小鼠随机分为3组正常组、模型组、生理盐水对照组，每组12只。

1.2.2模型制作： 模型组：先以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，将手术台上放置成人尿垫，防止手术低体温现象，使小鼠向右侧卧，暴露背部左肾区，剃去左肾区毛发备皮，以安尔碘消毒，70%酒精脱碘，从距左脊肋骨0.5 cm处作斜向外方切口。经后腹膜取肾脏，暴露肾脏，结扎后切除整个左肾，缝合。放置于干燥新鼠笼内，待其苏醒后能自行饮食饮水，为第一步切肾手术成功，术后如前饲养一周。1周后行Alzet微渗透泵置入手术，先以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，使小鼠俯卧，暴露后颈部，剃去后颈部毛发备皮，以安尔碘消毒，70%酒精脱碘，在后颈部作一个1.5 cm横切口，以血管钳分离皮下组织至右腰部，植入内置Ang II的Alzet微渗透泵缝合，在放置ALZET微渗透泵过程中，应将开口朝内防止渗出药物污染伤口，影响实验及伤口愈合。生理盐水对照组：造模方法同上。正常组不做处理。模型组中Alzet微渗透泵灌注Ang II，生理盐水对照组中Alzet微渗透泵灌注生理盐水。

1.2.3标本采集及标本制作：

1.2.3.1尿液: 在造模4周后处死前1 d用代谢笼收集实验各组小鼠的尿液测24 h尿蛋白定量。

1.2.3.2血液: 各组实验小鼠，造模4周后处死，眶静脉采血待测。

1.2.3.3肾脏组织：右肾组织用4%中性甲醛溶液固定，经脱水、包埋，切成2 μm厚石蜡片作HE、Masson染色。

表1　各组小鼠0、2、4周收缩压的结果

与同期正常组比较,*P<0.05，**P<0.01， 与同期模型组比较,△P<0.05，△△P<0.01.

Note.Compared with the normal group in the same periods,*P<0.05,**P<0.01.Compared with the model group in the same periods,△P<0.05,△△P<0.01.

表2　实验结束时各组小鼠血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量的结果 ±s)

与同期正常组比较, *P<0.05, **P<0.01。与模型组比较△△P<0.01。

Note.Compared with the normal group in the same periods. *P<0.05，**P<0.01.Compared with the model group in the same periods,△△P<0.01.

1.2.4观察指标及方法：

造模前及造模后第2、4周无创血压仪测小鼠血压(每次每只小鼠测量10次取平均值)。造模后4周后处死全部小鼠，眶静脉采血测Scr、BUN， 24 h尿蛋白定量检测。用光镜观察HE、Masson染色肾组织病理变化。

1.2.5数据处理与统计分析：计数资料用X2检验，计量资料用t检验，组间比较用方差分析。分析所得数据采用SPSS 15.0统计软件分别进行统计分析，P≤0.05将被视为所检验的数据有统计学意义,P≤0.01将被视为有高度显著性统计学意义。

2结果

2.1造模前及造模后2、4周收缩压的比较

结果：造模后2周时，生理盐水对照组(P<0.05)及模型组(P<0.01)的血压较正常组升高，模型组较生理盐水对照组也升高(P<0.05)；造模后4周时，模型组血压较正常组(P<0.01)及生理盐水对照组(P<0.05)均升高(表1)。

2.2造模4周后各组小鼠血肌酐、血尿素氮、24h尿蛋白定量的比较。

实验结束时，生理盐水对照组及模型组的血肌酐数值较正常组均上升(P<0.05)；模型组的血尿素氮数值较正常组升高(P<0.05)，而与生理盐水对照组比较无明显差异；模型组较正常组与生理盐水对照组的24 h尿蛋白定量数值升高(P<0.01)(表2)。

2.3小鼠肾组织HE染色结果

HE染色结果：正常组肾小球及肾小管未见明显异常。生理盐水对照组及模型组出现近曲小管上皮细胞浑浊肿胀，模型组较多；生理盐水对照组及模型组肾小球均未见明显异常(图1，见文后彩插6)。

2.4小鼠肾组织Masson染色

Masson染色结果：正常组和假手术组仅在血管和基底膜处有绿染的胶原纤维，间质成分比较少。模型组胶原成分增多，大量的间质细胞浸润，绿染的胶原纤维明显增多(图2，见文后彩插6)。

Masson染色胶原阳性率结果比较：模型组Masson结果胶原纤维阳性率显著高于正常组和生理盐水对照组(P<0.05)(图3)。

图3　各组小鼠胶原纤维阳性率比较。 Fig.3　Comparison of the positive rates of collagen fibers in the mice of each group

3讨论

目前肾纤维化模型较多，以往对肾纤维化的研究多通过单侧输尿管结扎模型和慢性肾衰竭大、小鼠动物模型进行，更符合梗阻性肾损害患者。经典的肾衰竭模型有阳离子化牛血清白蛋白制作的慢性肾衰动物模型、腺嘌呤诱导的慢性肾衰动物模型、肾大部切除慢性肾衰动物模型。其模型的发病机理与高血压导致的肾纤维化相去甚远。目前常用的高血压模型有自发型高血压模型[3,4]，但是其不一定能发生肾损伤。肾动脉结扎法制作的高血压模型[5-7]，方法有两肾一夹型肾血管性高血压大鼠模型、单肾单夹型肾血管性高血压大鼠模型、双肾双夹型肾血管性高血压大鼠模型，此种高血压模型属于继发性高血压，所以不能归结为原发性高血压。其他还有高糖高脂饮食诱导高代谢型高血压模型等[8]，也不能成功诱发高血压肾损害而产生肾纤维化。高血压肾损害通常是指原发性的高血压所致的肾脏小动脉硬化或肾实质损害[9]。肾素血管紧张素系统是原发性高血压主要的机制之一，血管紧张素II又是肾素血管紧张素系统中，最重要的缩血管物质，在高血压发生发展中具有重要作用。国内外许多学者应用外源性灌注血管紧张素II诱导大小鼠制作高血压模型[10，11]，因这类模型为血管紧张素II引起的高血压，可以将其归于原发性高血压范畴。

Ang II具有很高的生物活性，是血管紧张素系统中最主要的效应物质，可以升高全身血压及肾小球毛细血管内压直接参与进行性肾脏损害，导致肾脏小动脉硬化或肾实质损害，可引起肾脏血管收缩造成肾血流量的下降和肾脏血管阻力的增加，肾小球内压力也随之升高，系膜细胞收缩，导致对蛋白的选择性通透性增加、并能激活与纤维化相关的生长因子，通过调节炎症和纤维化的过程，参与肾脏疾病的发病机制[12]。

高血压肾损害的临床表现为持续性的高血压，并伴有持续性微量白蛋白尿或轻中度蛋白尿，或出现肾功能损害(如肌酐、尿素氮升高)等临床表现。本研究在造模前及造模后2周、4周时模型组血压较正常组与对照组都升高，说明模型组已经出现血压升高现象(表1)。当实验结束时，模型组的血肌酐、血尿素氮数值较正常组均上升(P<0.05)；模型组24 h尿蛋白定量数值较正常组与生理盐水对照组的升高(P<0.01)(表2)。本研究中模型组血压升高后已经出现蛋白尿及肌酐、尿素氮的升高，则说明该模型已经出现高血压肾损害症状。高血压肾损害的早期病理表现通常为良性肾硬化，肾小球及肾间质小管出现缺血性损害，如肾小管间质细胞缺血肿胀等，高血压早期大多数肾小球形态正常，仅有少量肾小管萎缩，间质纤维化，晚期可见到肾小球硬化和严重的间质小管损伤，即肾小管多灶状和片状萎缩部分代偿肥大，大量肾间质纤维化[9]。本研究模型组HE病理表现为近曲小管上皮细胞浑浊肿胀，正是近曲小管缺血的表现，证明该模型已经出现了高血压肾损害的病理表现，生理盐水组因体内盐分较多，所以也会出现轻微的损害近曲小管上皮细胞。胶原纤维在正常肾组织的表达很少，而在肾间质纤维化时则表达较多，本研究中模型组Masson染色病理表现为大量的间质细胞浸润及绿染的胶原纤维明显增多。胶原是反应肾纤维化的主要指标，Masson染色证明模型组已经出现肾脏纤维化。

目前大部分高血压模型及肾纤维化模型，都不满足高血压肾损害至肾纤维化。而本研究通过外源性灌注Ang II，使小鼠血压升高，并且切除小鼠一侧肾脏后，另一侧成为孤立肾，是高血压完全作用与孤立肾上，加重肾脏损害，进而缩短实验周期，同时使纤维化程度加重，并且所观察到的肾脏无机械性损伤。当造模4周后，模型已经出现了蛋白尿及肌酐、尿素氮的升高现象，证明该模型已经出现高血压肾损害现象。本研究中HE染色证明模型已经出现近曲小管上皮细胞浑浊肿胀现象，证明该模型以出现肾损伤现象。Masson证明纤维化已经形成，证明该模型为高血压肾损害至肾纤维化模型。如想制作纤维化程度较重的模型，则可以增加Ang II灌注时间。因此，单侧肾切除+微渗透泵灌注血管紧张素II可以成功建立小鼠肾纤维化模型及高血压模型，是较为理想高血压肾损害致肾纤维化模型。

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〔修回日期〕2014-12-15