猪圆环病毒2型悬浮培养工艺的研究进展

郭玲花 王丽敏 肖 燕 孙进忠

(普莱柯生物工程股份有限公司,河南洛阳 471003)

猪圆环病毒2型悬浮培养工艺的研究进展

郭玲花 王丽敏 肖 燕 孙进忠

(普莱柯生物工程股份有限公司,河南洛阳 471003)

猪圆环病毒2型（Porcine circovi rus type2，PCV2）流行广泛，能损害免疫系统，多继发其他病原的混合感染，影响养猪业的健康发展。疫苗能有效防治PCV2，减少病毒对猪群的损害。对目前国内外市场上PCV2疫苗的制备工艺及其优缺点进行对比分析，发现利用悬浮培养工艺培养PK-15细胞来增殖PCV2，在PCV2疫苗的制备上具有广阔的市场前景。

猪圆环病毒2型 悬浮培养 PK-15细胞 疫苗制备

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）感染是近年来发现的一种比较难控制的传染病，该病主要侵害哺乳仔猪和育肥猪，对怀孕母猪也有较大影响。其特征性临床症状为患病猪体质不良、皮肤苍白。PCV有PCV1和PCV2两种血清型，其中PCV1无临床致病性，PCV2有临床致病性（Allan G，2002）。PCV2感染后可导致猪体免疫抑制及抵抗力低下，影响猪体对部分疫病免疫抗体的产生和维持，继发其他病原的混合感染。感染猪圆环病毒2型引起的相关疾病主要有：断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、急性肺水肿（APE）、猪皮炎与肾病综合征（PDNS）等（GRAU-ROMA L.CRISCI E，2008）。目前，猪圆环病毒2型在我国已普遍存在，表现为流行范围广、阳性率高、混合感染严重、种猪感染率高等特点，严重影响猪群健康，给养猪业造成重大的经济损失，养猪行业人士已将该病列为当前危害养猪业发展的头号疫病。因此PCV2疫苗的有效使用，对于该病的防控具有重要意义。

目前国内外商品化的PCV2疫苗有很多种，一般分为全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。即使是杆状病毒或者大肠杆菌表达系统表达的PCV2 Cap蛋白制备的亚单位疫苗，也是因为Cap蛋白可以在一定的条件下形成病毒样粒子（virus-like particles，VLPs），免疫猪只后才可以对PCV2产生较好的免疫力。由于亚单位疫苗生产成本较全病毒灭活疫苗高很多，价格相对昂贵，目前市场上使用范围较广的多为全病毒灭活疫苗，但由于全病毒灭活疫苗的生产主要都采用细胞转瓶培养的方法，而现有培养PCV2的PK-15系细胞在体外增殖培养PCV2的能力不强，致使PCV2产量及效价较低，疫苗批间质量差别较大（刘长明，2005）。随着国内疫苗生产企业的数量逐步增加，企业间的竞争导致利润空间下降，要想在保证疫苗效果的前提下提升市场竞争力，就需要优化疫苗生产工艺，降低生产成本，减少批间差异，保证产品的质量稳定。随着细胞培养技术的不断发展与成熟，大量细胞已被驯化为悬浮培养方式，普遍应用于病毒的大规模培养。本文将对细胞悬浮培养技术，特别是PCV2细胞悬浮培养工艺的研究现状进行简单介绍：

1 细胞悬浮培养技术的应用

病毒的培养方法有组织细胞增殖、禽胚增殖、易感动物体内增殖，疫苗制备中一般选用细胞培养的方法来增殖病毒。根据细胞生长特性，一般有方瓶培养、转瓶培养和悬浮培养，其中转瓶工艺劳动强度大，许多人同时进行长时间的消化传代操作，污染风险较高，同时其生产周期长，生产效率较低，成产成本较高。而悬浮培养工艺可控制一系列细胞培养参数，具有培养病毒含量高，无须混合，批间差异小，培养方式自动化，无须大量生产人员，培养需求面积小、污染小等优点，是疫苗制备中首选的细胞培养技术。

随着细胞培养技术的不断发展与成熟，大量细胞已被驯化为悬浮培养方式，普遍应用于病毒的大规模培养。国外早在1962年，Capstick PB等开始利用BHK21细胞，进行悬浮培养繁殖FMDV的实验（Capstick PB，1962）；1965年，Telling R.C.等使用不锈钢发酵罐悬浮培养BHK21细胞进行FMDV的生产（Doel TR，2003）。

国内关于采用细胞悬浮培养工艺制备疫苗的研究也在不断发展成熟，周燕等进行了Vero细胞悬浮培养猪流行性腹泻病毒生产工艺条件的优化（周燕，2005）；冯磊等利用微载体，实现了Marc-145细胞的悬浮培养来增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒（冯磊，2012）；龚迪等通过探索促进MDCK细胞贴壁的关键组分，筛选

出用麦麸水解物代替血清的低血清培养基，放大培养，微载体细胞贴壁均匀、生长旺盛，为流感疫苗的规模化生产奠定基础（龚迪，2012）；张良艳等用直接法和间接法分别驯化MDCK细胞，获得了较高的病毒滴度，为用细胞培养代替鸡胚制备流感病毒疫苗奠定基础（张良艳，2013）；林美玲等以Vero细胞为基质，初步建立了微载体反应器无血清悬浮培养HSV-Ⅱ病毒的生产工艺，新老微载体比3：1，至少4次级联放大，为疫苗简便、高效的规模化生产提供参考（林美玲，2014）；熊炜等通过悬浮培养BHK-21细胞，增殖乙脑病毒，制备乙脑疫苗，该方法能工业化规模生产，疫苗稳定且免疫效力高（熊炜，2011）；李阳等通过鸡胚成纤维细胞的悬浮培养制备新城疫疫苗，工艺简单稳定易操作，疫苗安全性好，免疫效力高，对强毒攻击有完全的免疫保护（李阳，2013）；李阳等通过悬浮培养制备PRRSV灭活疫苗，缩短了生产周期，降低了人员配置，污染概率小，占地面积小，批间差异小，产品稳定高效，副反应小，疫苗质量得到显著提高（李阳，2014）。

2 PK-15细胞悬浮培养PCV2工艺的研究

PCV2常用PK-15细胞进行病毒的增殖，由于PK-15细胞贴壁生长，目前现有制备猪圆环病毒灭活疫苗的生产工艺大多以方瓶培养与转瓶培养为主，方瓶培养工艺病毒产量较低，转瓶培养工艺车间需大面积温室培养条件及相对多的实验人员，污染概率增加，产品效力不可控制，病毒含量较低，配制疫苗时需要浓缩，且转瓶培养细胞生长状态的差异易导致疫苗批间参差不齐等问题。市场急需要一类免疫原性良好、大规模生产时批间稳定、培养周期短、病毒含量高、销售价格合理的PCV2疫苗，而悬浮培养工艺相比于方瓶培养和转瓶培养，具有生产量大、生长周期短、批间稳定、可全自动化控制与监视、降低劳动力成本等优点，因此用PK-15细胞的悬浮培养来增殖PCV2，在制备PCV2灭活疫苗中具有明显优势。

国内关于PK-15细胞悬浮培养PCV2的研究越来越多。南京农业大学何锡忠等（何锡忠，2009）利用Celli Gen生物反应器，进行了悬浮培养PK-15细胞来繁殖PCV2的实验研究。5L的反应器中，微载体为5g/L，0.2%LH的无血清LG-DMEM培养基将病毒液作10×稀释，接种于传代后24h的 PK-15细胞。设置参数为40%的空气饱和度，50rpm的搅拌速度，37℃，PH为7.10，进行PCV2的培养增殖，同时设立方瓶培养与转瓶培养对照。对接毒24h收获的病毒液进行TCID50测定，得出方瓶培养的病毒毒价为104.0TCID50/ m l，转瓶培养的病毒毒价为105.5TCID50/ml，悬浮培养的病毒毒价为105.0TCID50/m l，悬浮培养和转瓶培养的毒价比方瓶培养的高，但悬浮培养相比于转瓶培养，具有生产量大、批间稳定、可全自动化控制与监视等优势，可以作为PCV2增殖的首选，此实验证明了PK-15细胞悬浮培养PCV2的可行性，为制备更有效的PCV2疫苗奠定基础。

张许科等以BTONOCⅡ聚酯纤维微载体为基础，优化微载体密度为5.5g/500m l培养液，采用潮汐式微载体悬浮培养技术增殖病毒，单台生物器规模达500～1000L，收获病毒效价≥106.0TCID50/m l，提高了疫苗产量和毒价，减少了细胞切向压力，而且无O2供应限制和无泡沫烦恼（张许科，2010）；徐宏军等以Cytodex-1微载体为基础，密度为3～5g/L，利用生物反应器微载体悬浮培养带毒PK-15细胞，容积能达3～3000L，病毒效价稳定在106.5～6.7TCID50/m l，密封，减少其他病菌污染，提高了疫苗产品的安全性（徐宏军，2013）；钱钟等将片状载体密度设置为250g/L细胞液，采用灌注悬浮培养技术增殖PCV2，病毒效价高达106.5TCID50/m l，培养基中血清含量低，降低了疫苗的生产成本（钱钟，2014）；董彦鹏等以Cytodex-1微载体为基础，密度为5～10g/L，生物反应器达100L，病毒效价高达107.0TCID50/m l，用伴豆球蛋白A和水解酪蛋白的无血清低糖DMEM作细胞培养维持液，制备的抗原没有血清残留，PCV2疫苗的安全性更高（董彦鹏，2014）。综合对比悬浮培养技术与转瓶培养技术或方瓶培养技术，细胞悬浮培养工艺在PCV2灭活疫苗的制备中显示出明显的优势，会越来越广泛的应用于PCV2灭活疫苗的制备。

3 小结

PCV2悬浮培养技术具有病毒产量高毒价高、生产周期短、污染小、批间稳定、操作方便、可自动化控制、培养需求面积小、降低劳动力成本、易于大规模生产等优势，是增殖PCV2的首选。采用PK-15细胞的悬浮培养增殖PCV2，对于PCV2灭活疫苗的制备具有重要意义，也是PCV2灭活疫苗制备的主流模式和必然趋势，但是相对比较成熟的细胞悬浮驯化培养工艺，还需要最适无血清培养基和添加物的选择及病毒培养过程中技术参数的进一步研究。随着细胞悬浮培养工艺技术的优化与成熟，使用更有效的PK-15细胞悬浮培养工艺增殖PCV2，将有利于提高PCV2灭活疫苗的质量和产量，进而提高企业的生产效益和竞争力。

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郭玲花（1987-），女，专科生。

公益性行业（农业）科研专项经费（201303046）资助。

孙进忠，高级兽医师，从事兽用生物制品工程技术的研究。