种公牛精液冷冻保存的研究进展

2015-01-24王鸿周施巧婷王二耀冯亚杰陈付英吴姣赵洪昌徐照学

中国牛业科学 2015年1期

关键词：稀释液抗氧化剂公牛

王鸿周，施巧婷，王二耀，冯亚杰，陈付英，吴姣，赵洪昌，徐照学*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450008)

综述

种公牛精液冷冻保存的研究进展

王鸿周1,2，施巧婷2，王二耀2，冯亚杰2，陈付英2，吴姣1,2，赵洪昌1,2，徐照学2*

(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450008)

本文分析从精子的生理特性,冷冻保存的原理,不同稀释液对精子冷冻效果的影响,抗氧化剂在种公牛精液冷冻保存中的应用进展,不同保存环境对解冻后精液品质的影响等方面综述了公牛精液冷冻,保存解冻的研究进展。

公牛精液;冷冻保存;研究进展

国家十二五规划，提倡肉牛养殖鼓励进行集中育肥，大力向专业化和规模化标准养殖发展靠拢,提升肉牛养殖的生产效率。优秀种公牛在肉牛种群的繁殖改良和生产发展中发挥着重要的作用，精液冷冻技术则为更好地发挥种公牛的作用提供了有力的保证，冷冻精液是广泛应用于现代畜牧业中的一项重要技术，它克服了时间、地域和年龄对种公牛利用的限制，极大地增加了优秀种公畜的利用效率和范围[1]。牛的冷冻技术在生产中的应用,源自于1951年,世界上第一头通过冷冻精液进行人工授精牛犊的成功诞生[2]，随后人们开始对精液冷冻的各个步骤包括稀释液配方、稀释倍数和稀释方法、甘油浓度、精液平衡温度和时间、降温速度以及解冻方法等进行研究，促使精液冷冻技术取得了长足的进步，我国于1958年开始精液冷冻技术的研究，到目前为止对牛的精液冷冻保存研究已较为成熟，商业化冻精生产也较为普遍，但对精液冷冻技术的研究还需要深入，以解决精液冷冻-解冻后精子质量达不到理想效果的问题。本文通过对最新的牛精液冷冻技术的研究进展进行综述，期望对生产中牛精液的冷冻和保存提供一定的参考,以提高冷冻精液的品质。

1 精子的生理特性

精子是一种雄性配子，在睾丸的曲精细管内产生形成，经睾丸网到达附睾，完成其成熟过程，精子的形成过程是一种复杂的细胞学变化，雄性动物的遗传物质经过精子来传递，精子可以在体外一定条件下维持受精能力，这使得精液在体外保存成为可能。精子从睾丸内生成到受精完成，伴随环境的改变，精子也会发生对应的生理变化。精清是种公牛在射精时运载精子并对精子有保护和营养作用的物质，由少量睾丸液、附睾液及各种副性腺的分泌物组成。精清中含有各种提供能量的糖类、调节渗透压平衡的柠檬酸和其他有机成分，和与受精有关的乳酸、尿酸、醋酸、乙醇酸等微量有机酸及抗坏血酸等，还有调节代谢的蛋白质、氨基酸和酶类，此外，还有核酸、脂类、脂肪酸和对精子防冻有保护作用并延长精子存活时间的前列腺素、钠钾等无机成分和维生素。有些成分的功能和作用已经研究清楚，例如，牛精液中已分析过的维生素有硫胺素、核黄素、抗坏血酸、泛酸等，这些成分的存在有利于提高精子的活力和密度。有些成分(如维生素B12和维生素E类似物)对精子有抗冻保护的作用机理尚不清楚还需要继续深入研究。精清是精子体外生存的环境，其成分应和精子的生理需要相符[3]。生产中应充分了解精子的理化特性，以及所含营养成分的含量、种类及功能，对精子和精清两者之间的关系则应进行更加深入的研究。

2 精液的冷冻保存原理

精液冷冻保存是利用液氮(-196℃)、干冰(-79℃)或其他冷源将精液经过适当处理后，保存在超低温条件下，以达到长期保存的目的，精子保存在超低温状态下，其代谢活动完全受到抑制，只是生命以相对静止状态保持下来，当温度改变升温解冻后则又能复苏并还具有受精能力。精子之所以能够复苏的关键在于精液在冷冻过程中加入了冷冻保护剂，在冷冻剂的作用下，使得精子水分冰晶化对精子造成的破坏大幅度减少，而形成玻璃化[4]。关于精液冷冻保存的具体机制尚不清楚，目前有五种代表性的假说[5]，这些假说都各自揭示了细胞在冷冻过程中受到的冷冻损伤原理。冷冻蚀刻技术表明冷冻细胞受到冰晶排挤后处于高渗透压的环境之中，从而导致细胞失水萎缩，离子不平衡，在解冻过程中造成细胞肿胀，胞膜破裂[6]，从而对精细胞造成损伤。在精液冷冻时要防止冰晶的形成，需采取有效的方式快速度过冰晶期，在生产冻精时，首先应在3～5℃冰柜平衡分装，然后在-90～-130℃冷冻温度熏蒸7～8 min，最后放于-196℃液氮中保存，使精液经冻结处理后能较完整地保存精子的结构和生理机能。在超低温(-196℃)条件下，冻精物理化学性质最稳定，精子处于长期休眠状态，冻精经过解冻后就会复苏，便具有较强的生理机能[7]。

3 不同稀释液对精子冷冻效果的影响

目前对精液稀释液的研究已有很多，都是旨在研究筛选出适合不同品种的最佳稀释液配方，以提高精液冷冻的效果。赵家才等[8]对BMY牛冷冻精液的稀释液进行筛选试验发现，以TRIS-果糖为基础液经过添加不同的糖类和氨基酸所得的新稀释液获得了较好的效果，其中添加蔗糖和乳糖的效果较为明显，添加氨基酸取得的效果不太理想。稀释液的种类和配方对冷冻精液的效果非常重要，组成稀释液的主要成分包含糖类、盐类、蛋白类及一些抗冻保护剂。常用的糖类有葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖等，稀释液的糖类物质不仅为精细胞提供能量，还具有一定的防冻作用，Woelders等[9]发现，海藻糖和蔗糖都具有在冷冻环境下保护精子免受伤害的作用，而蔗糖的保护效果更好。卵黄对精子抗冻保护也具有重要作用，卵黄配合抗冻剂甘油对精液的冷冻保存具有重要的作用，然而也有不使用卵黄的，Moussaa等[10]发现在牛精子冷冻过程中，可以利用抗低温打击能力强的低密度脂蛋白(LDL)代替卵黄的作用，而且其冷冻精液效果也较好。LDL对精子的保护作用机理是通过脂质与精子膜结合，防止细胞膜的完整性受到破坏。只是目前无卵黄稀释液价格较高，出于经济效益的考虑，有些种公牛站又开始使用有卵黄稀释液。稀释液中卵黄的添加量一般在15%～20%，必须进行充分搅拌混匀[11]。也有运用卵磷脂代替卵黄的研究，并取得了良好的效果[12]，卵磷脂也具有一定的抗氧化和延缓衰老的作用[13]。胡传活等[14]发现以含1.5%、3%、4.5%及6%四种不同浓度的卵磷脂稀释液冷冻牛的精液，除了含6%卵磷脂试验组外，其余3个试验组都可获得与含20%卵黄的常用稀释液相当或更好的精液质量，其中含1.5%卵磷脂的稀释液效果最好。甘油作为常用的冷冻保护剂，冷冻效果虽好，但因其对精细胞有一定的毒害作用，甘油浓度影响种公牛精液冷冻后活力和顶体完整率[15]，生产中运用一步稀释法能达到理想的效果[16]，对于有条件的种公牛站可以采用二步稀释法，解冻后要注意去除甘油再进行人工授精，以减少对精细胞的损伤。目前，对于甘油替代品的研究开发仍需继续研究。目前国内外稀释液的种类很多，研究发现[17]进口稀释液和国内稀释液对奶牛和肉牛冷冻精液的活率和畸形率影响不大，但是使用国内稀释液稀释的奶牛和肉牛精液的顶体完整率显著高于使用稀进口释液稀释的奶牛和肉牛精液的顶体完整率，受胎率也较好。

4 抗氧化剂在种公牛精液冷冻保存中的应用进展

在冷冻-解冻过程中会产生对精细胞有害的活性氧(ROS)物质，精细胞的氧化损伤程度与精子冷冻效果有密切关系[18]，ROS对精细胞的损伤机制是：在正常条件下，精子的ROS量处于动态平衡状态，在精液的冷冻一解冻过程中因精子与外界环境相接触，由于外界各种因素的相互作用，增加了死亡精子和受损精子的数量，致使这种平衡被打破，导致产生过多的ROS，精子ROS量增加，引起精子膜的流动性改变，线粒体和DNA损伤，从而，引起精液品质降低[19]，再者，虽然在精浆中存在能够清除ROS的抗氧化酶，但牛精子本身并不含有过氧化氢酶，含有的谷胱甘肽过氧化酶也较少，不足以抵抗ROS的作用[20]，这就需要在牛精液冷冻过程中添加抗氧化剂来保护精细胞减弱ROS的损伤。抗氧化剂的种类主要有维生素类、酶类和其他抗氧化剂。Ollero等[21]研究发现，维生素E是机体中重要的抗氧化剂，能提高精子顶体完整率和降低精子畸形率，且能提高冻精解冻后的精子活力。赵宪林等[22]研究发现在我国秦川牛精子稀释液中添加维生素E显著提高了冷冻精液解冻后的精子活力，精液品质明显得到改善。并且，在我国秦川牛精子稀释液中添加维生素E的适宜添加量为0.04～0.08 mg/mL。张莺莺等[23]研究在稀释液中添加中药提取液发现，牛精子的活率、顶体完整率和质膜完整率都有较好的效果，这主要是因为其中药成分中含有丰富的天然抗氧化剂和其他对抑制脂类氧化反应具有增效作用的物质，这些成分在抵御脂类物质氧化损伤和保护精子质膜完整性上起到了积极作用。然而，中草药成分在精子冷冻时的积极作用机理有待于进一步的研究。褪黑激素可以刺激过氧化岐化酶和谷胱甘肽过氧化物酶的抗氧化酶活性，它不仅具有高亲脂性还具有部分亲水性，能够抑制过氧化氢引起的过氧化脂质含量的升高，有效清除在化学反应中产生的羟自由基，在精液冷冻过程中发挥着重要的抗氧化作用[24]，它对不同类型的细胞都有抗氧化和抗凋亡作用[25]。李晓霞等[26]研究发现添加褪黑激素可以抑制ROS诱发的精子氧化损伤，提高精子活力、质膜完整性和顶体完整性，对提高牛精液的保存质量和保存时间具有显著作用，其适宜添加量为10-3 mol/L。目前，对抗氧化剂的研究主要集中于单独加入抗氧化剂的研究方面，不同抗氧化剂联合在家畜精液冷冻保存中的应用则少有报道，各抗氧化剂之间是否有协同作用的研究也较少，特别是维生素类和酶类抗氧化剂的联合应用，应该加大不同抗氧化剂联合应用，以便更好的改善冷冻解冻后的精子质量[27]。李志凌等[28]研究人的精子冷冻储存发现，在精液进行冷冻处理前进行精子优选，将死精子和劣质精子去除，可以显著减少冷冻-解冻过程中ROS产生，说明精液优选对精液冷冻保存具有显著的作用。目前，精子优选方法在牛精液的冷冻保存上尚未见报道，分析其原因可能是精液优选会增加冷冻生产强度，增加成本，建议在以后的牛精液冷冻研究中尝试使用精子优选的方法，研究其对牛精液冷冻效果的影响，简化其操作过程，使其能够运用于牛的冷冻精液生产中。

5 不同保存环境对解冻后精液品质的影响

张晋青等[29]研究了青藏高原牛冷冻精液超长期保存的效果，发现精子冷冻保存长达35年，在解冻后进行生产使用，仍可以产生后代，且后代犊牛生活力强、采食好、生长快，未出现任何遗传上的异常情况。说明液氮超低温保存精液是保存生物遗传资源的一种有效方法，也是建立生物基因库的重要手段，但应避免多次取拿，因为多次取拿会引起精液所处温度发生变化，对精细胞造成伤害，导致活力降低。解冻后的精液与超低温保存相比，存活时间会明显缩短，聂德宝等[30]对精液品质的影响研究了不同保存环境对牛解冻后精液品质的影响发现，解冻后0.5 h的时候，保存在冰水以及30℃的精子活力没有明显差异，精子的活力均在合格范围内。但在2 h以后就出现了显著差异，在30℃环境中的精子活力明显降低了，低于0.35的国家标准，而冰水中的精子活力没有明显的变化。由于培养时间短，细菌菌落数变化不明显。孙光华等[31]在0～5℃、24～27℃两个温度范围进行了精液解冻后保存试验，结果发现以0～5℃范围解冻后保存效果较好，存活时间可达12 h，常温(24～27℃)解冻后存活时间仅为4 h。潘和平等[32]通过研究早胜牛的冷冻精液发现，早胜牛在75℃解冻精子活率最高，但保存时间不长，只适用于体温短时问保存并立即进行输精，而38℃解冻后保存于0～5℃的条件下，精子保持活力的的时间最长。高春国等[33]研究曲靖肉牛的冷冻精液发现，精液解冻后在低温( 4℃)保存6 h，常温( 10～15℃)保存4 h和高温( 28℃)保存2 h以内输精对受胎率没有显著的影响，冻精解冻后在高温28℃)保存4 h以上，受胎率会明显下降。说明保存温度对冻精解冻后精子寿命影响很大。在实际使用冷冻精液进行人工授精操作中，应根据操作场地和种公牛站的距离远近，技术设施条件，合理选择精液解冻后的保存温度，以保持精液在受精时具有较高的活率。

6 小结

精液冷冻保存受各种因素的影响，要想取得理想的冷冻效果，就必须注意把握影响精液品质的各个环节。不同品种的种公牛、以及同一品种的不同个体间精液质量也有显著差异，应尽量避免夏季对种公牛的利用，夏季高温会影响种公牛的精液品质，使精液品质下降。同时应注意加强对种公牛的饲养管理，在接种疫苗后注意让种公牛有一个恢复休息期[34]，注意采精频率和采精方法[35]的应用。也有采集放牧散养牛的精液，经过处理稀释处理后过一段时间带回种公牛站进行冷冻的研究[36]，证明牛精液在采集后经过适当处理，可以保存一定的时间再进行冷冻保存，这可以解决生产中和种公牛站距离较远的种牛精液保存问题，但在提高效率方面还需要进一步的细化研究。在精液冷冻保存的过程中应严格按照操作规程来做，选择合理的稀释液配方，注意对冷冻过程中温度的把握，以取得良好的冷冻效果。进行人工授精之前，应对解冻后的精液进行品质检查，不符合国家标准的坚决不能进行输精操作。冷冻、解冻和输精过程中要严格无菌操作，避免因感染降低受精率。

种公牛的精子冷冻技术研究，需要多借鉴其他畜种包括人类的冷冻技术研究方法和新技术。根据不同的牛品种选择合理的精液冷冻研究方法，加强实验确定各个营养成分的最适添加量，优化稀释液配方以获得高品质的冷冻精液。对稀释液有些成分的作用机理不太清楚，还需要进行更加深入的实验研究，以进一步增加了解。种公牛站应加强对技术人员的培训，严把精液生产的各个环节，加强新技术的应用，及时解决遇到的问题，生产品质优良的冻精。

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Research Progress of Semen Cryopreservation of Bulls

WANG Hong-zhou, SHI Qiao-ting, WANG Er-yao, FENG Ya-jie, CHEN Fu-ying,WU Jiao, ZHAO Hong-chang, XU Zhao-xue

(1.DepartmentofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou, 450002,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450008,China)

This article reviewed the research progress of semen cryopreservation of bulls, including saving and thawing from many aspects, such as physiological characteristics of the sperm, the principle of cryopreservation. Moreover, the following aspects were included, such as the influence of different diluents on sperm freezing effect, the application progress of using antioxidant in bulls' semen cryopreservation and the influence of semen quality after thawing under different keeping environment.

Bull; Semen; Cryopreservation; Research Progress.