小RNA治疗流感病毒的研究进展

陈潇楷

广东医学院生物化学与分子生物学教研室，广东东莞523808

小RNA治疗流感病毒的研究进展

陈潇楷

广东医学院生物化学与分子生物学教研室，广东东莞523808

流感病毒引起的急性呼吸道传染病，一直以来严重影响人类健康。目前防治流感病毒的常规方法依然是疫苗和药物，但存在滞后性、耐药性等限制。由小RNA（sRNA）介导的RNA干扰（RNAi）提供了一种新型有效的抗病毒策略，已应用到SARS、HIV、RSV、HCV等多种病毒的临床试验。随着RNAi研究的深入，应用sRNA抗流感病毒的报道也逐渐增加。相对于传统的抗流感病毒药物，针对流感病毒基因保守区的特异性siRNAs和miRNAs具有更好的抗病毒效果，并避免耐药性的产生，具有较好的应用前景。

小RNA；流感病毒；siRNA；miRNA

甲型流感病毒容易发生抗原性转变（antigenic shift）形成新的亚型，如H1N1、H7N9、H10N8［1］，导致流感大流行，严重影响人类健康。疫苗和药物在一定程度上能抑制流感病毒，改善患者症状，但仍存在许多限制。Orozovic等［2］报道抗流感药物金刚烷胺（Aman tadine）、金刚乙胺（Rimantadine）、扎那米韦（Zanamivir）、奥司他韦（Oseltamivir）均已出现不同程度的耐药，且耐药病毒株日益增加。RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导的沉默特定基因表达的技术，广泛应用于肿瘤、心血管等疾病的治疗。小RNA（RNAs）介导的RNAi具有普遍性、高效性、高度特异性等特点，已开始作为抗病毒治疗的候选方案之一［3］。本文就sRNA介导的RNAi在抗流感病毒的作用及应用前景进行综述。

1 小RNA概述

sRNA是指不具有蛋白编码能力，核苷酸长度＜60 nt的RNA。根据sRNA的来源与作用，主要分为，①microRNA（miRNA）：由RNA聚合酶Ⅱ转录调节产生的宿主来源17～24 nt小RNA，能够在mRNA和蛋白水平上发挥调节作用；②short interfering RNA（siRNA）：由内源性Ⅲ型核酸内切酶Dicer加工处理多种dsRNA后产生的21～23 nt RNA，通过RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合到与其完全互补的靶位点，介导mRNA沉默；③Piwiinteracting RNAs（piRNAs)：哺乳动物生殖细胞中分离得到的一类长度约为30 nt的小RNA，与Piwi蛋白家族成员结合调节基因转录、翻译和维持mRNA稳定性；④virus-derived interfering RNAs（viRNAs）：参与线虫类、节肢动物和植物抗病毒固有免疫，如流感病毒小病毒RNA（small viral RNAs，svRNA），是长度为22～27 nt的单链RNA，由甲型流感病毒以病毒RNA为模板转录合成；⑤clustered regularly interspaced short palindromic repeat RNAs（crRNAs）：参与原核细胞的适应性免疫，如细菌抵御噬菌体的感染［4-5］。

RNA通过序列特异性相互作用，参与mRNA和病原体来源基因组RNA靶位点的转录，影响靶位点的完整性和功能，广泛参与细胞分裂、细胞凋亡、细胞内信号传递、免疫功能和细胞运动等［6］。在植物和无脊椎动物中，病毒感染能诱发自然的RNAi实现抗病毒作用，随后学者报道在哺乳动物身上也能通过RNAi发挥抗病毒作用［7-8］。

2 小RNA作用机制

RNAi通过dsRNA诱发的同源mRNA特异性降解或阻碍特定基因的转录或翻译而抑制基因表达。dsRNA可来源于病毒复制中间体和病毒基因组的不完全RNA发夹结构［9］。双链siRNA形成后，在RNA结合蛋白TRBP的帮助下，与RISC复合体核心蛋白Ago2结合，Ago2将siRNA正义链切除，而反义链与完全互补的靶基因mRNA结合，通过Ago2裂解靶基因，有效抑制靶基因的表达［10］。

与siRNA不同，miRNA基因组经转录产生初级pri-miRNA，由细胞核内RNaseⅢ家族蛋白Drosa和dsRNA结合蛋白DGCR等组成的微处理机复合体裂解，产生60～70 nt具有茎环结构的发夹前体premiRNA，在Ran-GTP依赖的转运蛋白Exportin 5作用下，从细胞核运输至胞浆中（图1）［11］。胞浆内的premiRNA由Dicer通过类似于siRNA的方式识别和加工处理，Dicer裂解dsRNA后，反义链保留在RISC上，以序列依赖的方式结合到目的基因mRNA上。结合miRNA的RISC一般与目的mRNA不完全互补，互补配对高的可对靶mRNA进行降解，而配对低的可封闭靶mRNA，抑制翻译［12］。

3 siRNA与流感病毒

甲型流感病毒是单负链分节段RNA病毒，具有8个RNA片段，不同RNA片段在病毒复制和感染中发挥不同的作用，干扰其中任意一个片段都可以不同程度抑制病毒的复制［13］。有效的siRNA策略需考虑以下几个方面：①流感病毒基因组RNA片段由NP蛋白包裹，因此siRNA必须靶定mRNA而不是基因组RNA；②为了使设计的siRNA能长时间发挥作用，靶位点应是mRNA中最保守的序列［14］。Wu等［15］针对PB2、PB1、NP和M2、M1设计了10个siRNA，分别转染A549细胞，然后以感染复数0.001 H1N1病毒液感染细胞，感染24 h后，RT-PCR结果显示，与对照组相比，10个siRNA均能使靶基因的表达下调70%，而只有靶定PB1，PB2和PA的siRNA使NP基因转录减少70%。Western blot结果显示，与对照组相比，除了MP-969和MP-559siRNA，其余siRNA均能使NP蛋白减少60%以上。Li等［16］将包含有针对PB1-siRNA的shRNA克隆到pSIREN穿梭载体，并将其转染至MDCK细胞，然后以感染复数0.1的H1N1病毒液（A/ PR/8/34）感染细胞，48 h后病毒滴度降低了50倍；随后在鸡胚及小鼠上进行同样的实验，鸡胚尿囊液病毒滴度降低了100倍，小鼠存活率为50%～100%。此实验结果显示，靶向性干扰PB1片段能够抑制病毒在细胞和鸡胚中的复制［16］。该实验为siRNA作为治疗流感病毒的候选药物提供可能性。

虽然还没有市售的siRNA用于流感的治疗，但美国圣诺制药公司发展了一种靶向性抑制H1N1和H5N1保守区域的专利产品——多靶点小核苷酸药物STP702，目前已在申请临床试验，其目标是开发针对多种流感病毒株的STP702，包括H1N1、H5N1、H3N2、H7N2和H9N2亚型［17］。另外，将人源化单链Fv抗体（humanized single-chain Fv antibody，huscFv）连接到阳离子脂质体，构成抗流感病毒的免疫脂质体siRNA—MDR-03030，显示出理想的临床前研究结果。在小鼠和雪貂模型，通过鼻内给予MDR-03030治疗甲型流感病毒感染，明显提高了实验动物的生存率，此药物已经通过美国FDA审批。使用huscFv作为靶向剂将siRNA传递到特定的细胞，可避免siRNA触发的先天性免疫反应，增强siRNA传送效率和特异性，增加了siRNA作为预防或治疗流感病毒感染的可能性［18］。免疫脂质体传递的成功取决于细胞抗原是否大量表达，因此，开发HA抗体构成的免疫脂质体，介导抗流感病毒药物传递到病毒感染细胞是一种具有发展前景的治疗方法。

4 microRNA与流感病毒

miRNA在调节病毒生命周期和细胞内转录过程、病毒和宿主相互作用中发挥重要作用。在病毒感染过程，宿主细胞内miR-449b能调节脱乙酰化酶-1的表达和干扰素-β分泌，进而调控干扰素诱导的抗病毒活性［19］。转染HA miR-192能明显抑制病毒在MDCK和A549细胞中的复制，而且用转染HA miR-192的病毒感染小鼠，即使增加10倍的病毒感染量，在感染8 d后，小鼠存活率为100%。实验结果表明，HA基因特异性miRNA的表达能够抵抗流感病毒的感染并可能预防病毒引起的疾病［20］。

Song等［21］研究证实，miR-323、miR-491和miR-645可靶向H1N1病毒PB1基因的3'非翻译保守区，降解PB1基因mRNA，从而抑制H1N1病毒在MDCK细胞中复制。进一步研究发现，这些结合位点在各种流感病毒毒株中高度保守。也有研究证实，靶向性结合H1N1病毒M1基因cRNA3'非翻译区的miR let-7c，能调控M1基因RNA和蛋白表达，从而抑制H1N1病毒在A549细胞中的复制［22］。上述研究提示，针对流感病毒基因片段的靶向性miRNAs具有抵御流感病毒的作用，可能发展为抗流感病毒药物。

在人类体液中存在着由细胞产生的游离miRNA，称为循环miRNA。循环中的miRNA通常包装成类似于胞外体的微粒，可免受内源性RNA酶的降解，使其在体液中高度稳定。但在不同的病理条件下，血清miRNA的表达谱会发生一定的变化，使其成为一种有效的诊断标志物，已用于阿尔茨海默病、冠心病和肿瘤等的诊断［23］。Tambyah等［24］研究报道，在流感病毒H1N1或者H3N2严重感染的50个患者中，有193个miRNA的表达发生了显著变化，其中75个miRNA表达上调，118个miRNA表达下调，提示miRNA可用于流感病毒感染的诊断。

5 svRNA与流感病毒

svRNA与病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）相互作用，调控病毒的转录和翻译。流感病毒RdRp是由PA、PB1、PB2组成的异源三聚体，在病毒基因组的复制和转录等生命周期中具有关键作用。RdRp在A、B、C型流感病毒中高度保守，其功能位点的氨基酸突变对流感病毒是不利的，因此PA、PB1、PB2是重要的抗病毒靶点［25］。svRNA的合成需要功能性RdRp、NP和NEP，缺少任何一个组分都会导致svRNA的合成下降。将携带Flag标签的GFP及A型流感病毒蛋白质粒PB2，PB1，PA，RdRp，NP及NS1与包含5'三磷酸的非结构svRNA类似物共转染成纤维细胞，Flag免疫共沉淀反应及Northern blot实验结果显示svRNA只与完整的RdRp结合［26］。PA/PB1 X射线结晶衍射结果显示PA表面有个包含K328、K539、R566三个保守碱性氨基酸残基的凹槽，进一步研究证实凹槽对SvRNA-RdRp间的互动具有重要作用，且R566残基是svRNA进入PA的关键残基［27］。以上研究表明，svRNA的缺失可能影响RdRp功能的发挥，可通过下调svRNA的表达抑制RdRp活性，提示svRNA可能是一个潜在的抗病毒靶标。

6 小结

与一般的有机化学药物相比，sRNA作为潜在治疗药物具有一定的优势：①siRNA设计迅速并能大量生产；②sRNA可抑制特定靶基因的表达，而对宿主没有影响；③可以使用多种小RNA以减少耐药性。与此同时，sRNA药物也存在一些问题，如脱靶效应、不稳定性和有效性传递等［28］。由于sRNA分子量大，亲水性强，无法单独扩散进入细胞膜，因此传递载体是sRNA治疗的最大障碍。目前已有多种非病毒性载体如配体偶联、与胆固醇共轭结合、与人源化抗体结合、脂肽纳米粒子，其中脂肽纳米粒子在基因沉默方面具有理想效果［29］。

RNAi基因组筛选技术与生物信息学的结合，能够识别参与流感病毒耐药性、敏感性和病毒复制转录有关的宿主因子，有助于发现更多潜在的抗病毒靶点。RNAi干扰技术不仅仅是基因功能分析的有利工具，同时也是发展高特异性sRNA基因沉默治疗的工具。随着RNAi技术的不断发展，siRNA、miRNA在流感病毒的治疗已从实验室进入到临床试验，推动RNA在预防治疗流感病毒的进程。

［1］To KKW，Tsang AKL，Chan JFW，et al.Emergence in China of human disease due to avian influenza A（H10N8）-cause for concern?［J］.J Infect，2014，68（3）：205-215.

［2］Orozovic G，Orozovic K，Jorhult JD，et al.Study of Oseltamivir and Zanamivir resistance-related mutations in Influenza viruses isolated from wild mallards in sweden［J］.PloS One，2014，9（2）：e89306.

［3］鲁毅，李任峰，徐萍，等.RNAi的抗病毒机制及应用［J］.生命的化学，2011，31（4）：514-518.

［4］Li Y，Kowdley KV.MicroRNAs in common human diseases［J］.GPB，2012，10（5）：246-253.

［5］Tenoever BR.RNA viruses and the host microRNA machinery［J］.Nat Rev Microbiol，2013，11（3）：169-180.

［6］李泽，白荷露.小RNA的组成和功能——三类内源小RNA的研究概况［J］.生物技术通报，2013，（1）：25-30.

［7］Li Y，Lu J，Han Y，et al.RNA interference functions as an antiviral immunity mechanism in mammals［J］.Science，2013，342（6155）：231-234.

［8］Maillard PV，Ciaudo C，Marchais A，et al.Antiviral RNA interference in mammalian cells［J］.Science，2013，342（6155）：235-238.

［9］Shapiro JS，Langlois RA，Pham AM.Evidence for a cyto-plasmic microprocessor of pri-miRNAs［J］.Rna，2012，18（7）：1338-1346.

［10］Marques JT，Wang JP，Wang X，et al.Functional specialization of the small interfering RNA pathway in response to virus infection［J］.PLoS Pathog，2013，9（8）：e1003579.

［11］Ramachandran PV，Ignacimuthu S.RNA interference-a silent but an efficient therapeutic tool［J］.Appl biochem Biotechnol，2013，169（6）：1774-1889.

［12］Gavrilov K，Saltzman WM.The rapeutic siRNA：principles，challenges，and strategies［J］.Yale J Biol Med，2012，85（2）：187-200.

［13］Michael P，Brabant D，Bleiblo F，et al.Influenza A induced cellular signal transduction pathways［J］.J Thorac Dis，2013，5（Suppl 2）：S132.

［14］Liu Y，Chang Y，Xu D，et al.Optimised design of siRNA based on multi-featured comparison and analysis of H1N1 virus［J］.Int J Data Min Bioinform，2013，7（4）：345-357.

［15］Wu ZQ，YangYW，Yang F，et al.Effective siRNAs inhibit the replication of novel influenza A（H1N1）virus［J］.Antivir Res，2010，85（3）：559-561.

［16］Li W，Yang X，Jiang Y，et al.Inhibition of influenza A virus replication by RNA interference targeted against the PB1 subunit of the RNA polymerase gene［J］.Arch Virol，2011，156（11）：1979-1987.

［17］Barik S.New treatments for influenza［J］.BMC Med，2012，10（1）：104.

［18］Khantasup K，Kopermsub P，Chaichoun K，et al.Targeted small interfering RNA-immunoliposomes as a promising therapeutic agent against highly pathogenic avian influenza A（H5N1）virus infection［J］.Antimicrob Agents Chemother，2014，58（5）：2816-2824.

［19］Buggele WA，Krause KE，Horvath CM.Small RNA profiling of influenza A virus-infected cells identifies miR-449b as a regulator of histone deacetylase 1 and interferon beta［J］.PloS One，2013，8（9）：e76560.

［20］Langlois RA，Albrecht RA，Kimble B，et al.MicroRNA-based strategy to mitigate the risk of gain-of-function influenza studies［J］.Nat Biotech，2013，31（9）：844-847.

［21］Song L，Liu H，Gao S，et al.Cellular microRNAs inhibit replication of the H1N1 influenza A virus in infected cells［J］.J Virol，2010，84（17）：8849-8860.

［22］Ma YJ，Yang J，Fan XL，et al.Cellular microRNA let-7c inhibits M1 protein expression of the H1N1 influenza A virus in infected human lung epithelial cells［J］.J Cell Mol Med，2012，16（10）：2539-2546.

［23］Zhu Z，Qi Y，Ge A，et al.Comprehensive characterization of serum microRNA profile in response to the emerging avian influenza A（H7N9）virus infection in humans［J］. Viruses，2014，6（4）：1525-1539.

［24］Tambyah PA，Sepramaniam S，Ali JM，et al.MicroRNAs in circulation are altered in response to influenza a virus infection in humans［J］.PloS One，2013，8（10）：e76811.

［25］罗芬，马卫列，张志珍.甲型流感病毒RNA聚合酶—抗病毒药物靶点［J］.中国生物化学与分子生物学报，2014，30（5）：434-440.

［26］Perez JT，Varble A，Sachidanandam R，et al.Influenza A virus-generated small RNAs regulate the switch from transcription to replication［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（25）：11525-11530.

［27］Perez J T，Zlatev I，Aggarwal S，et al.A small-RNA enhancer of viral polymerase activity［J］.J Virol，2012，86（24）：13475-13485.

［28］Kanasty R，Dorkin JR，Vegas A，et al.Delivery materials for siRNA therapeutics［J］.Nat Mater，2013，12（11）：967-977.

［29］Dong Y，Love KT，Dorkin JR，et al.Lipopeptide nanoparticles for potent and selective siRNA delivery in rodents and nonhuman primates［J］.Proc Natl Acad Sci，2014，111（11）：3955-3960.

Research advances of sRNA therapy of influenza

CHEN Xiaokai
Department of Biochemistry and Molecular Biology,Guangdong Medical College,Guangdong Province,Dongguan 523808,China

Acute respiratory infections caused by influenza virus affectes human health seriously.Vaccines and drugs are conventional therapies,but there are many restricted factors,for instance,hysteresis and drug resistance.RNA interference(RNAi)mediated by small RNA(sRNA)provides a new,effective antiviral strategy,and it has been used in anti-viruses treatment such as SARS,HIV,RSV and HCV.With gradually researching on RNAi,application of sRNA in anti-influenza virus has been reported increasingly.And compared to conventional anti-virus drugs,the siRNAs and miRNAs which targeting conserved regions of the influenza virus have better inhibitory effect,and hard to produce drug resistance,and thus providing a promising therapeutic agents for anti-influenza virus.

Small RNA;Influenza virus;siRNA;miRNA

R373.1[

]A[

]1673-7210渊2015冤04渊a冤-0043-04

2014-12-14本文编辑：苏畅）

陈潇楷（1988.6-），男，广东医学院2012级临床检验诊断学专业在读硕士研究生；研究方向：抗流感病毒药物筛选。