乳腺癌中淋巴管生成与SOX2和血管内皮生长因子-C的关系

韩增磊 王丽娜 孔庆暖 卫红军 陈桦 黄维清

1.山东省青岛市市立医院病理科，山东青岛266000；2.山东省青岛市传染病医院检验科，山东青岛266000

乳腺癌中淋巴管生成与SOX2和血管内皮生长因子-C的关系

韩增磊1王丽娜2孔庆暖1卫红军1陈桦1黄维清1

1.山东省青岛市市立医院病理科，山东青岛266000；2.山东省青岛市传染病医院检验科，山东青岛266000

目的探讨乳腺癌中淋巴管生成与SOX2和血管内皮生长因子-C（VEGF-C）的关系，以及SOX2、VEGF-C、淋巴管生成与乳腺癌临床病理参数的关系。方法收集青岛市市立医院病理科2013年1月～2014年4月乳腺癌组织标本90例，采用免疫组化SP法检测各乳腺癌组织中SOX2、VEGF-C及Podoplanin的表达。比较分析不同临床分期及病理组织学分级的乳腺癌组织中SOX2、VEGF-C及淋巴管密度值（LVD）的表达情况。结果90例乳腺癌组织中，淋巴结转移者SOX2、VEGF-C和LVD的阳性率分别为84.62%、76.92%和61.54%，高于无淋巴结转移者（44.00%、48.00%、32.00%），差异均有统计学意义（χ2=15.23、7.05、6.33，P=0.00、0.01、0.01）。组织学分级Ⅱ～Ⅲ级者SOX2、VEGF-C的阳性率分别为82.35%、76.47%，高于组织学分级Ⅰ级者（45.45%、45.45%），差异均有统计学意义（χ2=11.57、7.46，P=0.00、0.01）。SOX2、VEGF-C阳性者LVD阳性率分别为60.60%和61.29%，高于SOX2、VEGF-C阴性者（33.33%、35.71%），差异均有统计学意义（χ2=5.26、5.07，P=0.02、0.02）。SOX2阳性者VEGF-C阳性率为75.76%，高于SOX2阴性者（50.00%），差异有统计学意义（χ2=5.45，P=0.02）。结论SOX2、VEGF-C、LVD阳性表达提示肿瘤的高侵袭性，且三者间均存在一定的相关性。SOX2在肿瘤中可能通过促进VEGF-C分泌诱导淋巴管生成。

乳腺癌；SOX2；血管内皮生长因子-C；Podoplanin；淋巴管生成；免疫组织化学

淋巴管生成在恶性肿瘤侵袭性生长及淋巴结转移中起着非常重要的作用，这个过程非常复杂，它与许多直接或间接的因素密切相关。podoplanin是一种淋巴管标志物，最早发现于肾小球足突细胞膜，属于Ⅰ型黏液样跨膜糖蛋白，一般只存在于较小的淋巴管，而不存在于大的淋巴管，如胸导管。研究已经证实，淋巴管生成与不同类型恶性肿瘤淋巴结转移及患者预后有关［1-2］。转录因子SOX基因家族尤其是其重要家族成员，近几年被广泛关注。较多研究表明SOX2基因异常表达与肿瘤的发生发展以及淋巴结转移相关［3-5］。血管内皮生长因子-C（VEGF-C）作为血管内皮生长因子家族中的一员，其促进淋巴管生成，并在恶性肿瘤淋巴结转移中的作用也有较多的研究［6-7］。但SOX2、VEGF-C与淋巴管生成之间的相互关系未见报道。本实验收集青岛市市立医院病理科乳腺癌90例，通过免疫组织化学SP法染色，探讨乳腺癌中淋巴管生成与SOX2和VEGF-C的关系，以及SOX2、VEGF-C、淋巴管生成与乳腺癌临床病理参数的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2013年1月～2014年4月青岛市市立医院病理科非特殊型浸润性乳腺癌组织标本90例，所有患者临床资料完整，50岁及以上者62例，淋巴结转移者65例，肿瘤的组织学分级根据SBR分级标准分为3级。

1.2 试剂

鼠抗人VEGF-C单克隆抗体、兔抗人SOX2单克隆抗体、鼠抗人podoplanin单克隆抗体、非免疫动物血清、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒及PV9000通用型标准试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

免疫组织化学SP法，组织切片常规脱蜡至水，内源性过氧化物酶阻断，高压热修复，分别滴加一抗，湿盒内4℃过夜；滴加试剂1，湿盒内37℃孵育20 min，滴加试剂2，湿盒内37℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封固。阴性对照采用与一抗浓度相同的同种非免疫动物血清IgG。VEGF-C、SOX2、podoplanin采用已知阳性切片作对照。

1.4 结果判定

SOX2和VEGF-C根据阳性细胞百分比及阳性细胞染色深浅计分，①＜10%为0分，10%～25%为1分，＞25%～50%为2分，＞50%～100%为3分。②无显色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。两者乘积作为判断标准：0分为（-），1～4分为（+），5～8分为（++），9分为（+++）。≤（+）为阴性，≥（++）为阳性。

肿瘤区域内凡是podoplanin阳性的单个内皮细胞或内皮细胞簇不论呈腔与否均视为淋巴管，淋巴管是否成腔不作为判定标准，但淋巴管之间必须有清楚的分离。先于低倍镜（100倍）下确定血管热区，选定血管最密集的区域3处，在高倍镜（400倍）下计数血管，取3个视野的均值作为淋巴管密度值（lymphatic vessel density，LVD）。取所有LVD值的中位数作为判定标准，小于中位数的为阴性，大于等于中位数的为阳性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析，计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SOX2表达与临床病理参数的关系

SOX2阳性部位为细胞核，着色为浅黄色至深褐色颗粒（图1），90例乳腺癌中66例SOX2阳性，阳性率为73.3%（66/90）。不同年龄及肿瘤大小患者，其SOX2表达情况比较，差异无统计学意义（χ2=1.70、0.81，均P＞0.05）。有淋巴结转移者和组织学分级Ⅱ～Ⅲ级者SOX2阳性率分别为84.62%（55/65）、82.35%（56/68），高于无淋巴结转移者和组织学分级Ⅰ级者的44.00%（11/25）、45.45%（10/22），差异均有统计学意义（χ2=15.23、11.57；P=0.00、0.00）。见表1。

2.2 VEGF-C表达与临床病理参数的关系

VEGF-C阳性部位为细胞质，着色为浅黄色至深褐色颗粒（图2），90例乳腺癌中62例VEGF-C阳性，不同年龄及肿瘤大小患者，其VEGF-C表达情况比较，差异无统计学意义（χ2=1.27、1.01，均P＞0.05）。有淋巴结转移和组织学分级Ⅱ～Ⅲ级者VEGF-C阳性率分别为76.92%（50/65）、76.47%（52/68），高于无淋巴结转移和组织学分级Ⅰ级者的48.00%（12/25）、45.45%（10/22），差异有统计学意义（χ2=7.05、7.46，P= 0.01、0.01）。见表1。

2.3 LVD与临床病理参数的关系

Podoplanin在薄壁淋巴管结构的内皮细胞浆或成簇的内皮细胞浆内呈阳性染色，大多呈弥漫的棕黄色（图3）。LVD值最小为0，最大为11，中位数为3.5。在90例乳腺癌中小于中位数即LVD阴性的例数为42例，大于等于中位数即LVD阳性的例数为48例。不同年龄、肿瘤大小及不同组织学分级患者，其LVD表达情况比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。有淋巴结转移者LVD阳性率为61.54%（40/65），高于无淋巴结转移组的阳性率［32.00%（8/25）］，差异有统计学意义（χ2=6.33，P=0.01）。见表1。

2.4 SOX2、VEGF-C、LVD相互之间的关系

SOX2阳性者和VEGF-C阳性者LVD阳性率分别为60.60%（40/66）和61.29%（38/62），高于SOX2阴性者和VEGF-C阴性者的33.33%（8/24）和35.71%（10/28），差异均有统计学意义（χ2=5.26、5.07，P=0.02、0.02），见表2。SOX2阳性者VEGF-C阳性率为75.76%（50/66），高于SOX2阴性者的50.00%（12/ 24），差异有统计学意义（χ2=5.45，P=0.02）。见表3。

3 讨论

3.1 SOX2与乳腺癌临床病理参数

SOX基因家族最早在Y染色体缺失小鼠中发现，它是具有羟甲基丁酸钙特征性结构的编码转录因子的一组基因，SOX2是其重要成员之一。近来研究表明，SOX2不但与肿瘤发生及肿瘤干细胞调控有关，而且与肿瘤侵袭性及淋巴结转移也有一定的关系［8-10］。本研究显示，SOX2的异常表达与患者的年龄、肿瘤大小均无关，而有淋巴结转移组SOX2阳性率明显高于无淋巴结转移组，且差异有统计学意义，这说明SOX2对肿瘤淋巴结转移起到了促进作用，此结果与牛艳清等［11］及李景贺等［12］的研究结果一致。在本研究中，组织学分级Ⅱ级和Ⅲ级的肿瘤SOX2阳性率明显高于组织学分级Ⅰ级者，差异有统计学意义，肿瘤的组织学分级越高说明肿瘤恶性度越高、侵袭性越强，由此说明SOX2阳性表达可以提示肿瘤的恶性程度更高。此结果与既往的研究结果一致［13-14］。这可能是因为SOX2作为一种干细胞转录因子，直接参与肿瘤的发生及发展，在肿瘤的发生阶段其高表达就决定了肿瘤的高恶性。

3.2 VEGF-C、LVD与乳腺癌临床病理参数

VEGF家族是一组特异作用于脉管内皮细胞的生长因子，它由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGFD、VEGF-E、胎盘生长因子等组成。VEGF-A可以促肿瘤血管生成以及增加血管通透性，其与许多肿瘤的转移有关。肿瘤转移是一个复杂的过程，血管生成在肿瘤转移中可能不是决定、甚至不是主要的作用，只是在转移发生过程中一系列影响因素之一［15］。不应片面夸大VEGF-A的促血管形成在肿瘤淋巴转移中的作用，而忽略淋巴管形成在肿瘤淋巴结转移中的作用。1996年Joukov等克隆并分离出VEGF家族的新成员——VEGF-C。VEGF-C主要在淋巴管的生成中起作用，Ding等［16］在胃癌的研究中提示肿瘤细胞中VEGFC高表达会促进肿瘤的生长及转移。本研究显示，组织学Ⅱ级和Ⅲ级者VEGF-C阳性率明显高于组织学Ⅰ级者，有淋巴结转移组明显高于无淋巴结转移者，且差异有统计学意义，这提示VEGF-C也可以作为肿瘤高度侵袭性的一个筛选指标，并且与肿瘤淋巴结转移有一定的关系，此结果与上述文献结果一致。在本实验中，有淋巴结转移者LVD阳性率明显高于无淋巴结转移者，且差异有统计学意义，而且VEGF-C阳性者LVD阳性率高于VEGF-C阴性者，差异有统计学意义，这说明淋巴管生成不但可以促进肿瘤淋巴结转移，而且与VEGF-C分泌具有一定的相关性，且呈正相关，这与Raica等［17］和Tammela等［18］的研究结果一致，其原因是肿瘤细胞分泌VEGF-C刺激了肿瘤中淋巴管的生成，并有可能改变淋巴管管壁通透性，从而使肿瘤细胞侵入淋巴管变得更容易，导致淋巴结转移可能性增加。

3.3 淋巴管生成与SOX2、VEGF-C的相互关系

SOX2与VEGF-C在乳腺癌中关系的研究未见报道，在本次研究中，SOX2及VEGF-C的表达与年龄、肿瘤大小均无关，但均与组织学分级及有无淋巴结转移相关。SOX2阳性者的VEGF-C及LVD的阳性率均高于SOX2阴性者，差异有统计学意义，这提示SOX2与VEGF-C和LVD有一定的相关性，SOX2的分泌对促进VEGF-C分泌及淋巴管的生成具有一定的作用，可能是肿瘤中SOX2通过某种机制调节VEGF-C的分泌，影响肿瘤中新生淋巴管生成，从而导致肿瘤淋巴结转移。

在本次研究结果中还可以看到，LVD仅与肿瘤淋巴结转移有关，而VEGF-C除与淋巴结转移有关外还与组织学分级有关，猜测可能的原因是，SOX2促进VEGF-C大量分泌，VEGF-C的受体为VEGFR-2和VEGFR-3，VEGFR-2表达于血管及淋巴管内皮细胞，而VEGFR-3的表达高度限制于淋巴管内皮细胞，VEGF-C优先与VEGFR-3结合，促进淋巴管生成，剩余的VEGF-C再与VEGFR-2结合，不仅促进淋巴管生成还促进血管生成，肿瘤中血管增多，血供丰富，为肿瘤的生长及间变提供基础，从而引起肿瘤恶性程度增高，组织学分级增高。本研究组猜想SOX2可能与肿瘤血管生成也有一定的关系，这可以作为下一步研究的问题。

综上所述，SOX2、VEGF-C或LVD阳性表达时肿瘤侵袭性增高，VEGF-C与LVD之间、SOX2与VEGF-C、LVD间具有一定的相关性。SOX2在肿瘤中可能通过促进VEGF-C分泌诱导淋巴管生成，从而影响肿瘤淋巴结转移。

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Correlations between lymphangiogenesis and SOX2,VEGF-C in breast carcinoma

HAN Zenglei1WANG Li'na2KONG Qingnuan1WEI Hongjun1CHEN Hua1HUANG Weiqing1
1.Department of Pathology,Qingdao Municipal Hospital,Shandong Province,Qingdao266000,China;2.Department of Laboratory,Qingdao Infectious Diseases Hospital,Shandong Province,Qingdao266000,China

ObjectiveTo investigate the correlations between lymphangiogenesis and SOX2,VEGF-C in breast carcinoma,and its associations with the clinical parameters of patients.MethodsImmunohistochemistry SP method was applied to detect the expression of SOX2,VEGF-C and podoplanin in 90 cases of breast carcinoma from the Department of Pathology in Qingdao Municipal Hospital from January 2013 to April 2014.The expression of SOX,VEGF-C and LVD in tissues of breast carcinoma with different clinical stage and histologic grading were compared and analyzed.ResultsIn 90 tissues of breast carcinoma,the positive rates of SOX2,VEGF-C and LVD in tissues of patients with lymph node metastasis were 84.62%,76.92 and 61.54%respectively,which were much higher than those of nonlymph-node-metastasis(44.00%,48.00%,32.00%),the differences were statistically significant(χ2=15.23,7.05,6.33;P=0.00,0.01,0.01).The positive rates of SOX2 and VEGF-C in tissues of patients with histological grade ofⅡ-Ⅲwere 82.35%and 76.47%respectively,which were much higher than 45.45%and 45.45%in patients with histological gradeⅠ,the differences were statistically significant(χ2=11.57,7.46;P=0.00,0.01).The positive rates of LVD were 60.60%and 61.29%in patients with positive expression of SOX2 and VEGF-C respectively,which were much higher than patients with negative expression of SOX2 and VEGF-C(33.33%,35.71%),the differences were statistically significant(χ2=5.26,5.07;P=0.02,0.02).The positive rates of VEGF-C was 75.76%in patients with positive expression of SOX2,which was much higher than those patients with negative expression of SOX2(50.00%),the difference was statistically significant(χ2=5.45,P＜0.05).ConclusionThe positive expression of SOX2,VEGF-C or LVD indicates highly malignant tumor and their expression levels are correlated.SOX2 may induce lymphangiogenesis by promoting the secretion of VEGF-C.

Breast carcinoma;SOX2;VEGF-C;Podoplanin;Lymphangiogenesis;Immunohistochemistry

R737.9［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0023-05

2014-11-26本文编辑：任念）

韩增磊（1976.12-），男，硕士；研究方向：病理诊断。

［作者简介］黄维清（1966.11-），女，硕士生导师，主任医师；研究方向：病理诊断。