肺表面活性物质对兔胸部撞击肺损伤中促炎性细胞因子的影响

王立 吴越 杜萍尹 宁康迪

新疆医科大学第六附属医院胸外科，新疆乌鲁木齐830002

肺表面活性物质对兔胸部撞击肺损伤中促炎性细胞因子的影响

王立 吴越 杜萍尹 宁康迪

新疆医科大学第六附属医院胸外科，新疆乌鲁木齐830002

目的观察肺表面活性物质（PS）对兔胸部撞击肺损伤中促炎性细胞因子的影响。方法选取新西兰大白兔113只，垂直撞击右侧胸部，复制急性肺损伤模型，随机分为对照组（n=38）、羊PS组（n=38）和牛PS组（n=37），分别以生理盐水、自制的羊PS和牛PS行支气管肺泡灌洗。采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定肺泡灌洗液和肺组织匀浆的白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）的含量。结果按照IL-1、IL-6、TNF-α的顺序，肺泡灌洗液中的含量依次为对照组［（155.10±20.31）、（175.10±22.34）、（89.57±80.55）pg/mL］、羊PS组［（90.62±4.15）、（80.51±4.72）、（46.79±20.61）pg/mL］、牛PS组［（81.49±3.56）、（77.94±3.05）、（52.04±15.97）pg/mL］，肺组织匀浆中的含量依次为对照组［（305.70±133.65）、（324.70±23.65）、（283.21±50.49）pg/mL］、羊PS组［（182.00± 27.69）、（178.00±21.96）、（150.34±4.88）pg/mL］、牛PS组［（179.20±34.37）、（173.20±24.07）、（145.52±10.95）pg/mL］。与对照组相比，羊PS组和牛PS组的含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论针对交通事故致胸部撞击肺损伤，采用胸部垂直撞击建立的兔急性肺损伤动物模型，分别以羊或牛PS行支气管肺泡灌洗，皆减少了肺泡灌洗液和肺组织匀浆中的促炎性细胞因子的含量，对促炎症细胞因子有一定的抑制作用。

肺表面活性物质；急性肺损伤；促炎性细胞因子

胸部撞击伤是交通事故和高处坠落的常见伤类。常用的急性肺损伤动物模型，往往使用油酸或脂多糖建立，和胸部创伤机制差异较大［1-3］。本研究以垂直撞击方式建立的兔急性肺损伤动物模型，分别以羊和牛肺表面活性物质（pulmonary surfactant，PS）行支气管肺泡灌洗，以生理盐水灌洗为对照组，ELISA法比较肺泡灌洗后促炎性细胞因子的含量，了解PS对促炎性细胞因子的影响，为进一步应用PS治疗胸部撞击肺损伤提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：新西兰大白兔由新疆医科大学实验动物中心提供，体重（2.250±0.263）kg，雌雄不限，按国际实验动物标准饲养，全组实验兔健康。

仪器和试剂：自制垂直胸部撞击固定支架和羊PS。血气分析仪为美国Nova Biomedical血气分析仪，试剂盒为美国Nova Biomedical血气分析仪专用。兔白介素-1（IL-1）、兔白介素-6（IL-6）、兔肿瘤坏死因子（TNF-α）测定试剂盒为上海源叶生物科技有限公司生产。牛肺表面活性剂（商品名珂立苏）：剂型为冻干粉针剂，成分为磷脂、胆固醇、三酰甘油、游离脂肪酸和少量肺表面活性物质蛋白（SP-B和SP-C），规格70 mg/2 mL，由北京双鹤药业生产。

1.2 方法

1.2.1 模型建立使用自行研制的垂直胸部撞击固定支架，1.5%戊巴比妥钠1 mL/kg兔耳缘静脉注射，分别以不同离地高度和质量的撞击物，呼气末准静态、自由落体的方式垂直撞击右侧胸部，撞击部位为右锁骨中线第四肋间。测量兔撞击接触面积、胸壁凹陷距离、氧分压和氧合指数、实验兔肺病理检查和肺干湿比，建立垂直胸部撞击致兔急性肺损伤动物模型。

1.2.2 急性肺损伤动物模型建立标准①动脉血氧合指数（PaO2/FiO2）≤300 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；②肺组织病理形态学观察及肺损伤病理评分；③肺干重/湿重比值测定，判断肺损伤、肺水肿程度。

1.2.3 分组采用随机分组，分为对照组（n=38）、羊PS组（n=38）和牛PS组（n=37），分别以生理盐水、自制的羊PS和牛PS行支气管肺泡灌洗。

1.2.4 羊肺表面活性物质制备新鲜羊肺用冷生理盐水多次灌洗，灌洗液进行低温离心，先以1500 r/min离心10 min清除细胞碎片后，获取的上清液在40℃下以40 000 r/min再次离心15 min，取得沉淀物为PS。予冷冻干燥，称重定量后用生理盐水稀释到12 g/L浓度冷藏待实验使用［4-8］。

1.2.5 支气管肺泡灌洗在动物模型建立4 h后实验兔头部抬高20°～30°，气管导管注入左肺浓度为12 g/L的羊PS 15 mL/kg或者相同剂量的牛PS，对照组左肺注入生理盐水15 mL/kg，并注入10 mL/kg氧气，增大潮气量20%，进行机械通气1 min后，低位引流灌洗液。动物模型建立12 h后处死动物，取肺组织做病理检查以及肺组织匀浆标本［8-10］。

1.2.6 肺泡灌洗液及肺组织匀浆中促炎性细胞因子的含量采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测肺泡灌洗液及肺组织匀浆中TNF-α、IL-1、IL-6的含量。

1.3 观察指标

1.3.1 促炎症细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6。

1.3.2 垂直撞击指数初步设定垂直撞击指数（CK）的计算公式：CK=（M×S×H）/（N×K）［9-10］。M（kg）：撞击物的质量；S（cm）：垂直撞击距离（离地高度）；H（cm）：兔胸壁凹陷距离；N（kg）：实验兔质量；K（cm2）：撞击接触面积。

1.3.3 实验兔肺脏器损伤评分标准肺伤情分级按AIS分级法。于撞击后14 h，采用统一的股动脉放血处死动物，进行胸部解剖，明确肺的损伤情况。动物脏器损伤评分标准见表1。

1.3.4 肺干重/湿重比值测量将左肺标本吸去表面液体，分析天平称肺湿重后，放置在电烤箱（80℃）中烘干，每24小时称重，直到重量不变时得到恒重（肺干重），代入公式，判断肺水肿程度。计算公式为：肺干重/湿重比=肺干重/肺湿重×100%。

1.3.5 急性肺损伤病理评分和肺组织病理形态学观察

右肺组织放入10%中性甲醛溶液固定48 h后，予脱水、包埋、苏木精伊红（HE）染色后光镜下观察肺组织病理形态。采用4项指标进行肺损伤评分：①肺泡充血；②间隙或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；③出血；④肺泡间隔增厚或透明膜形成。根据每项指标病变采用0～4分半定量分析，0分：无或极轻微损伤；1分：轻度损伤；2分：中度损伤；3分：重度损伤；4分：极重度损伤。各项评分的总和为急性肺损伤的病理评分。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验兔急性肺损伤病理学表现

双侧兔肺体积增大实变，表面有散在的大小不等红色斑片，部分肺组织有肋骨压迹，切面为红色实样变，可见红色泡沫样液体溢出，充血水肿状。光镜下双侧肺泡结构破坏，肺泡腔和肺间质呈现水肿、渗出、出血、大量粒细胞浸润、间质毛细血管内血流淤滞、白细胞附壁的表现。

2.2 三组实验兔肺干湿比、双肺+胸壁损伤评分、病理评分和垂直撞击指数比较

对照组、羊PS组、牛PS组肺干湿比、双肺+胸壁损伤评分、病理评分和垂直撞击指数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 三组实验兔肺干湿比、双肺+胸壁损伤评分、病理评分和垂直撞击指数比较

注：PS：肺表面活性物质

组别只数肺干湿比双肺+胸壁损伤评分（分）病理评分（分）垂直撞击指数对照组羊PS组牛PS组38 38 37 0.32±0.05 0.27±0.06 0.29±0.03 9.2±1.4 8.9±2.0 10.1±1.1 9±1 7±2 8±2 55±4 60±7 57±6

2.3 三组实验兔肺泡灌洗液中促炎性细胞因子水平比较

三组实验兔肺泡灌洗液中促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平比较：与对照组相比，羊PS组与牛PS组TNF-α、IL-1、IL-6水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；羊PS组与牛PS比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.4 三组实验兔肺组织匀浆中促炎性细胞因子水平比较

三组实验兔肺组织匀浆中促炎性细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平比较：与对照组相比，羊PS组与牛PS组TNF-α、IL-1、IL-6水平明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；羊PS组与牛PS比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨论

本研究以垂直撞击方式建立兔急性肺损伤动物模型，分别以羊或牛PS行支气管肺泡灌洗，以生理盐水灌洗为对照组，与对照组相比，羊PS组和牛PS组的肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1、IL-6、TNF-α含量均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与牛PS组相比，羊PS组肺泡灌洗液和肺组织匀浆中IL-1、IL-6、TNF-α含量差异无统计学意义（P＞0.05）。针对交通事故致胸部撞击肺损伤，采用胸部垂直撞击建立的兔急性肺损伤动物模型，分别以羊或牛PS行支气管肺泡灌洗，皆减少了肺泡灌洗液和肺组织匀浆中的促炎性细胞因子的含量，对促炎症细胞因子有一定的抑制作用。

胸部撞击致急性肺损伤无论是交通事故或高处坠落造成，均较为常见，是肺组织失控性炎性反应的结果［3-6］。促炎症细胞因子是由某些非免疫细胞及免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有较多生物学活性的小分子蛋白质，主要有TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、干扰素（IFN）等，参与炎性反应的发生、发展。PS是一种脂蛋白复合物，覆盖在哺乳动物的肺泡表面，主要作用是减少肺泡表面张力，增加肺顺应性，改善肺的气体交换，降低肺水肿和肺不张，还具有免疫作用和减轻炎性反应的作用［7-10］。天然（猪、牛等提取）和人工合成的PS制剂已应用于临床，在新生儿呼吸窘迫综合征（NRDS）和急性肺损伤等疾病的治疗作用中发挥出越来越明显的作用［8-11］。

对胸部撞击肺损伤造成的促炎性细胞因子介导的呼吸功能损害，如采取适当治疗措施，用PS对胸部撞击肺损伤动物模型行肺泡灌洗可降低炎症因子水平。了解PS对胸部撞击肺损伤中促炎性细胞因子的抑制作用，为研究胸部撞击致急性肺损伤的发生机制创造了条件，可进行胸部撞击致急性肺损伤以及继发性炎性反应的进一步研究［10-14］。但还需要观察其他促炎/抑炎细胞因子的变化，延长实验观察时间，进一步研究PS对兔急性肺损伤的影响作用。

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Effect of pulmonary surfactant on pro-inflammatory cytokines in rabbit's lung injury after chest impact

WANG LiWU YueDU PingYIN NingKANG Di
Department of Chest Surgery,Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi830002,China

ObjectiveTo observe the pulmonary surfactant(PS)effects on pro-inflammatory cytokines in rabbit's lung injury after chest impact.MethodsSelection of 113 New Zealand rabbits,vertical impacted on the right chest,replication animal model of acute lung injury,were randomly divided into control group(n=38),PS group of sheep(n=38)and bovine(n=37),respectively lavaged in bronchoalveolar with saline,homemade sheep pulmonary surfactant and bovine pulmonary surfactant.Using enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)method for the determination of bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue homogenate of interleukin-1(IL-1),interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor(TNF-α) content.ResultsIn accordance with IL-1,IL-6,TNF-α sequence,contents in bronchoalveolar lavage fluid were control group［(155.10±20.31),(175.10±22.34),(89.57±80.55)pg/mL］,the sheep PS group［(90.62±4.15),(80.51±4.72), (46.79±20.61)pg/mL］,the bovine PS group［(81.49±3.56),(77.94±3.05),(52.04±15.97)pg/mL］;content in lung tissue homogenate were control group［(305.70±133.65),(324.70±23.65),(283.21±50.49)pg/mL］,sheep PS group［(182.00± 27.69),(178.00±21.96),(150.34±4.88)pg/mL］,bovine PS group［(179.20±34.37),(173.20±24.07),(145.52±10.95)pg/mL］. Compared with the control group,the content of sheep PS group and bovine PS group were decreased,there were statistically significant differences(P＜0.05).ConclusionAccording to impact lung injury in chest caused by traffic accidents,establish a animal models of acute lung injury with vertical chest impact respectively in the rabbit,bronchoalveolar lavage with sheep or bovine PS,the content of proinflammatory cytokine reduced in bronchoalveolar lavage fluid and lung tissue homogenate,it has a certain degree of inhibition for proinflammatory cells factors.

Pulmonary surfactant;Acute lung injury;Pro-inflammatory cytokines

R655.3［

］A［

］1673-7210（2015）04（a）-0014-04

2015-01-02本文编辑：程铭）

新疆维吾尔自治区自然科学基金资助项目（编号2012211A039）。

王立（1974.7-），男，硕士，副主任医师；研究方向：胸外科，胸部损伤，急性肺损伤。